基因工程专题培训

1、基因工程专题培训专题1 基因工程基础理论和技术的发展催生了基因工程 DNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明 DNA双螺旋结构和中心法则的确立双螺旋结构和中心法则的确立 遗传密码的破译遗传密码的破译 基因转移载体的发现基因转移载体的发现 工具酶的发明工具酶的发明 DNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明 DNA体外重组的实现体外重组的实现 重组重组DNA表达实验的成功表达实验的成功 第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世 PCR技术的发明技术的发明基础理论基础理论技术发明技术发明 1. 1.什么叫基因？什么叫基因？思考讨论思考讨论3.3.遗传信息是如遗传信息是如何表达的？何表达的？ 2.

2、2.基因、基因、DNADNA、染色体、染色体之间是怎样的关系？之间是怎样的关系？（1）原核生物的基因结构）原核生物的基因结构编码区非编码区非编码区与与RNA聚合聚合酶结合位点酶结合位点1.基因的结构基因的结构 能够转录为相应的信使能够转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质质的合成，也就是说能够编码蛋白质 不能转录为信使不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质，不能编码蛋白质 非编码区：非编码区：编码区编码区 非编码区非编码区 非编码区非编码区 编码区编码区编码区下游编码区下游编码区上游编码区上游 RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点 调控遗传信息的表达调控

3、遗传信息的表达原核细胞基因的结构原核细胞基因的结构 RNA聚合酶结合位点：聚合酶结合位点：RNA聚合酶能够识别调控序列中的结聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿聚合酶沿DNA分子移分子移动，并与动，并与DNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从聚合酶也从DNA模板链上脱落下模板链上脱落下来。来。编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNA聚酶聚酶结合位点结合位点启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区上游

4、编码区上游 启动子是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表启动子是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能引导达的脱氧核苷酸序列，它能引导RNA聚合酶与正确的基因聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍的脱氧核苷酸序列，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。模板链上脱离下来，使转录终止。编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码

5、区与与RNA聚酶聚酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区上游编码区上游 （2）真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使内含子能转录为信使RNA 。内含子内含子: : 外显子外显子: : 编码区非编码区非编码区与与RNA聚合聚合酶结合位点酶结合位点信使信使RNA成熟的信使成熟的信使RNA真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白

6、质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列：有调控作用的核苷酸序列不能编码蛋白质的序列：不能编码蛋白质的序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是连续的。没编码区是连续的。没有内含子和外显子有内含子和外显子编码区是间隔的、不连续编码区是间隔的、不连续的。有内含子和外显子的。有内含子和外显子相同点相同点都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的。非编码区都有启动子、终止子非编码区组成的。非编码区都有启动子、终

7、止子和和RNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？2基因表达的调控基因表达的调控原核生物基因表达的调控原核生物基因表达的调控乳糖代谢基因表达调控图解：乳糖代谢基因表达调控图解：(存在葡萄糖时存在葡萄糖时) lacZ lacY lacA 调节基因调节基因启动子启动子操纵基因操纵基因结构基因结构基因RNA聚合酶聚合酶信使信使RNA转录转录翻译翻译阻抑物与阻抑物与操纵基因操纵基因结合，结结合，结构基因转构基因转录受阻录受阻阻抑物阻抑物原核生物基因表达的调控原核生物基因表

8、达的调控乳糖代谢基因表达调控图解：乳糖代谢基因表达调控图解：(只存在乳糖时只存在乳糖时) lacZ lacY lacA 调节基因调节基因启动子启动子操纵基因操纵基因结构基因结构基因RNA聚合酶聚合酶信使信使RNA转录转录翻译翻译阻抑物与乳糖结合后构象发生了改变，因而不能与操纵基阻抑物与乳糖结合后构象发生了改变，因而不能与操纵基因结合，使得结构基因进行转录。因结合，使得结构基因进行转录。阻抑物阻抑物乳糖乳糖转录转录半乳糖苷酶半乳糖苷酶酶酶酶酶基因工程基因工程产品产品抗虫害的玉米抗虫害的玉米转鱼抗寒基因转鱼抗寒基因的番茄的番茄转基因鲑转基因鲑鱼鱼转黄瓜抗青枯病基转黄瓜抗青枯病基因的甜椒因的甜椒乳汁

9、中含有人乳汁中含有人生长激素的转生长激素的转基因牛基因牛( (阿根阿根廷廷) )资料资料 位于费城托马斯位于费城托马斯杰斐逊大学的希拉里和她的同事成杰斐逊大学的希拉里和她的同事成功地将人体狂犬病抗体的功地将人体狂犬病抗体的DNA译码移入烟草作物中。译码移入烟草作物中。 转基因烟草作物可以产生一种人体蛋白质，而这种物转基因烟草作物可以产生一种人体蛋白质，而这种物质能抗击致命性的狂犬病病毒。质能抗击致命性的狂犬病病毒。 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特重组和转基因等技术，赋予生物以

10、新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重组技术生物体外生物体外基基 因因DNA分子水平分子水平剪切剪切重组重组导入导入表达表达人类需要的基因产物人类需要的基因产物重组重组DNADNA导导入入形形成成分子手术刀分子手术刀限制性内切酶限制性内切酶一、一、“ “分子手术刀分子手术刀” ” 限制性核酸内切酶（限制酶）限制性核酸内切酶（限制酶）1.1.来源：主要来自于原核生物，如：大肠杆菌来

11、源：主要来自于原核生物，如：大肠杆菌细胞内可分离出细胞内可分离出EcoEcoRIRI限制酶限制酶限制酶在原核生物中的作用 原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源的安全。所以，限制酶在原

12、核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。使之失效，从而达到保护自身的目的。含有某种限制酶的细胞，其含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。在细菌体内与相伴存在的修饰酶（甲基化酶）共同构成细菌在细菌体内与相伴存在的修饰酶（甲基化酶）共同构成细菌的限制修饰体系，起限制外来的限制修饰体系，起限制外来DNA、保护自身、保护自身DNA的作用的作用一、一、“ “分子手术

13、刀分子手术刀” ” 限制性核酸内切酶（限制酶）限制性核酸内切酶（限制酶）1.1.来源：主要来自于原核生物，如：大肠杆菌细胞内可来源：主要来自于原核生物，如：大肠杆菌细胞内可分离出分离出EcoEcoRIRI限制酶限制酶2.2.作用：识别特定的核苷酸序列并水解特定的两个作用：识别特定的核苷酸序列并水解特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。大多数限制酶能够识别核苷酸之间的磷酸二酯键。大多数限制酶能够识别的序列均为的序列均为6 6个核苷酸（个别个核苷酸（个别4 4、5 5、8 8）(1)限制酶识别序列的特点限制酶识别序列的特点 限制酶所识别的序列，无论是限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是个碱基还是4个

14、碱基，都可个碱基，都可以找到一条中心轴线，以中轴线双侧的以找到一条中心轴线，以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向上碱基呈反向对称，重复排列。对称，重复排列。 如：如：GAA TTC CCC GGG CTT AAG GGG CCC(2)切点：切点：AATTGCCTTAAG与与DNA酶有什么区别？酶有什么区别？磷酸二酯键磷酸二酯键实质：实质：DNA酶：不特异性识别序列水解酶：不特异性识别序列水解DNA水解产物：水解产物：DNA酶：酶：限制酶：限制酶：DNA片段片段基本单位基本单位脱氧核苷酸脱氧核苷酸能识别和切割双链能识别和切割双链DNA分子特异序列的核酸水解酶分子特异序列的核酸水解酶限制酶：限制酶：重

15、播重播3.3.作用结果：切割作用结果：切割DNADNA分子产生两种类型的末端：分子产生两种类型的末端：黏性末端和平末端黏性末端和平末端DNADNA被限制酶切断后有两个反向互补的被限制酶切断后有两个反向互补的“黏黏性末端性末端”。被同一种限制切断的几个。被同一种限制切断的几个DNADNA具有相具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。同的黏性末端，能够通过互补进行配对。(2)平末端平末端在识别顺序的对称轴上，对双链在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。同时切割。4.举例：举例：EcoRI限制酶能识别限制酶能识别GAATTC序列，并序列，并在在G和和A之间切开之间切开思考限制酶的命名限制酶的

16、命名第一个字母（大写、斜体）第一个字母（大写、斜体） 该酶的微生物属名该酶的微生物属名第二、三个字母（小写、斜体）第二、三个字母（小写、斜体） 代表微生物种名代表微生物种名第四个字母（斜体）第四个字母（斜体） 代表寄主菌的株或型代表寄主菌的株或型用罗马数码用罗马数码I I、IIII、IIIIII等区分同一株具等区分同一株具 有不同特异性的酶有不同特异性的酶例例 流感嗜血杆菌中三个酶的命名：流感嗜血杆菌中三个酶的命名：Haemophilus influenzae dHaemophilus influenzae d 属名属名 种名种名 株系株系 H in d H in d I I II II II

17、I III Hind Hind I I Hind Hind II II Hind Hind III III 限制酶的限制酶的分类分类 根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为：酶活性可分为： I I型型 II II型型 III III型型1.I1.I型限制酶型限制酶属于复合功能酶，兼有修饰和切割属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNADNA两种特性。两种特性。2.III2.III型酶型酶与与I I型酶特性类似，也有甲基化功能，但无型酶特性类似，也有甲基化功能，但无ATPATP酶和酶和DNADNA解旋酶活力。解旋酶活力。在在DNAD

18、NA链上有特异位点切割，其切割位点在链上有特异位点切割，其切割位点在识别位点以外。识别位点以外。3. II3. II型酶型酶（1 1）IIII型酶的识别型酶的识别 识别序列一般为识别序列一般为4-64-6个碱基对，通常是反转个碱基对，通常是反转重复顺序，具有重复顺序，具有180180的旋转对称性。的旋转对称性。（2 2）IIII型酶的切割功能型酶的切割功能55端黏性末端（端黏性末端（cohesive end)cohesive end) 在识别顺序的双侧末端切割在识别顺序的双侧末端切割DNADNA双链，于对称轴的双链，于对称轴的55末端切割。末端切割。黏性末端黏性末端 33端黏性末端端黏性末端

19、在识别顺序的双侧末端切割在识别顺序的双侧末端切割DNADNA双链，于对双链，于对称轴的称轴的33末端切割。末端切割。少数有特殊性质的酶少数有特殊性质的酶异源同工酶（异源同工酶（isoschizomerisoschizomer） 定义：定义： 来源不同但能识别和切割同一位点的酶。来源不同但能识别和切割同一位点的酶。同尾酶（同尾酶（isocaudarner) isocaudarner) 为识别与切割顺序相互有关的酶。为识别与切割顺序相互有关的酶。 有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的识别顺序之中识别顺序之中 酶来源不同，但它们作用后能产生相同的粘性酶来源

20、不同，但它们作用后能产生相同的粘性末端。末端。DNADNA连接酶连接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G同种限制酶切同种限制酶切割割1.作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个重组的为一个重组的DNA分子分子 DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶一样吗？为什么？聚合酶一样吗？为什么？ 注意：注意：DNA连接酶只能作用于双链连接酶只能作用于双链DNA分

21、子而不分子而不 能将二个单链能将二个单链DNA分子连接。分子连接。（1 1）从大肠杆菌中分离得到：）从大肠杆菌中分离得到：E.coliDNAE.coliDNA连接酶，只能将双连接酶，只能将双链链DNADNA片段互补的粘性末端之间连接。片段互补的粘性末端之间连接。（2 2）从）从T T4 4噬菌体中分离到：噬菌体中分离到： T T4 4DNADNA连接酶，既可以连接酶，既可以“缝合缝合”双链双链DNADNA片段互补的粘性末端，又可以片段互补的粘性末端，又可以“缝合缝合”双链双链DNADNA片片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。3.分类（酶的来源）分类（酶的来源）T4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接带粘性末端连接酶连接带粘性末端DNADNA分子的效率分子的效率远高于连接平末端的远高于连接平末端的DNADNA分子分子连接反应需要连接反应需要ATPATP提供能量。提供能量。三、基因的载体“分子运输车”2.载体必须具备的条件：载体必须具备的条件：（1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；）能够在宿