普通生物学实验三

1、普通生物学实验（三） 教 案目 录35、细菌的简单染色、革蓝氏染色336、细菌的芽孢、荚膜、鞭毛染色鉴定及运动性观察537、微生物细胞形态及菌落特征观察1138、培养基制作、灭菌与无菌操作接种技术 1939、微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数35附：微生物的菌种保藏4140、微生物鉴定中常用的生化反应45附：微生物自动鉴定仪鉴定4841、微生物细胞大小测定及显微镜直接计数 5142、乳酸菌分离及食用乳酸制作 55乳酸菌分离与鉴定55食用乳酸制作5543、微生物营养和环境条件设计实验 5744、水体中微生物检测 62水体中细菌总数的检测62水体中大肠菌群的检测65参考文献68实验三十五 细菌的简

2、单染色及革兰氏染色一、实验目的与要求1、 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法；2、 学习显微镜油镜观察的方法；3、 进一步学习并掌握无菌操作技术要点。二、重点与难点1、 在取菌涂片的过程中怎样操作才能保证斜面菌种不受到污染？2、革兰氏染色实验中首先是涂片的厚薄会对结果有很大影响；其次是在媒染1min后一定要用水洗去碘液，此步不可以省去；第三脱色2025s应立即水洗。三、教学方法与手段本次实验课主要采取讲授法和演示法,辅以视频影象资料进行教学。四、实验内容1、 细菌的简单染色；2、 细菌的革兰氏染色。五、实验原理用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，

3、能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿）等使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（C+）和革兰氏阴性菌（

4、G）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。六、实验材料1、活材料：培养1216h的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草杆菌（Bacillus subtil

5、is）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），培养24h 的大肠杆菌（Escherichia coli）。2、染色液和试剂：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、番红、复红、二甲苯、香柏油。七、实验用品废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、滴管、玻片搁架、镊子、洗瓶、香柏油、无菌水、生物显微镜等。八、实验方法（一）简单染色1、涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金芽胞杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块，挑刚制成的苏云金芽胞杆菌浓菌悬液23环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取23环涂

6、在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。2、晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用文火烘干。是否还有其它方法？3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰23次固定，以不烫手为宜。为什幺要进行该步骤？4、染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色12min。5、水洗：用水洗去涂片上的染色液。6、干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。7、镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。怎样操作才能做到既快而又不易损坏玻片地调准焦距？（二）革兰氏染色1、涂片：涂片方法与

7、简单染色涂片法相同。涂片厚薄对结果有影响吗？2、晾干：与简单染色法相同。3、固定：与简单染色法相同。4、结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量的结晶紫染色液染色1min，以盖满细菌涂面。5、水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。6、媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。7、水洗：用水洗去碘液，此步可否省去？8、脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇，脱色2025s至流出液无色，立即水洗。为什么要立即水洗？9、复染：滴加番红复染25min。10、水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。11、晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。12、镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌

8、体的革兰氏染色反应性。13、实验完毕后的处理 将浸过油的镜头按下述方法擦试干净:先用擦镜纸将油镜头上的油擦去；用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦23次；再用干净的擦镜纸将镜头擦23次，注意擦镜头时向一个方向擦试。 观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，并放入盛有75%酒精溶液的回收缸中。 显微镜复原并做好使用登记。九、作业与思考题（一）、绘图1、 简单染色后绘出苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）的形态图。2、 革兰氏染

9、色后绘图并注明金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）两菌的革兰氏染色的反应性。（二）思考题2、 在取菌涂片的过程中怎样操作才能保证斜面菌种不受到污染？3、 革兰氏染色成败的关键操作是哪一步？为什么？4、 为什么革兰氏染色法要选用幼龄菌种？实验三十六 细菌的芽孢、荚膜、鞭毛染色及运动性观察一、实验目的与要求1、 学习并掌握细菌芽孢染色法，初步了解芽孢杆菌的形态特征；2、 学习并掌握细菌荚膜染色法；3、 学习并初步掌握细菌鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征；4、 学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。二、重点与难点1、细菌芽孢染色

10、实验中改良的Schaeffer和Fulton氏染色法试管中菌悬液应充分打匀，制成浓稠的菌液。Schaeffer与Fulton氏染色法涂片后加染色液用酒精灯火焰加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。2、采用负染色法进行细菌荚膜染色过程中，制片后应将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。若采用湿墨水法则要注意在制好的菌液上加盖玻片时勿留气泡，以免影响结果观察。而干墨水法中要用6%葡萄糖液与菌体充分混匀。三、教学方法与手段本次实验课主要采取讲授法和演示法,辅以视频影象资料进行教学。实验过程中1-4项实验内容会按照学生分组情况调整各小组每个实验进行的先后顺序。四、实验内容1、 细菌芽孢染色；2、

11、 细菌荚膜染色；3、 细菌鞭毛染色；4、 细菌的运动性观察。五、实验原理细菌的芽孢壁较细胞壁厚而致密，透性低，不易着色，也不易脱色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色，芽胞呈无色透明状。芽孢染色法就是基于细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同，用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈现不同的颜色而加以区别。所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色。当芽孢着色时，菌体也会着色，然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。再用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，形成鲜明的对照，便于观察。荚膜是包在细菌细胞壁外面的一层黏胶状或胶质状物

12、质，成分为多糖、糖蛋白或多肽，与染料间的亲和力弱，不易着色，故通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一浅色或无色的透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形，影响观察结果。细菌的鞭毛极细，直径一般为1020nm ,超过了普通光学显微镜的分辨力，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，将鞭毛直径加粗，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。细菌是否具

13、有鞭毛是细菌分类鉴定重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果只需查清供试菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或水封片法即压滴法，直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。此法较快速、简便。悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有凹槽的载玻片中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。水封片法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。细菌依赖鞭毛的运动方式，与鞭毛的排列形式和数目有关，但根据细菌的运动方式，对鞭毛的数目和排列方式只能作大致判断。单毛菌和丛毛菌多做直线运动，周毛菌多

14、做翻转运动。依赖鞭毛的运动称为真性运动。无鞭毛细菌做左右颤动而不改变其位置，这种运动称为非真性运动，亦称布朗运动。六、实验材料1、活材料：培养36h的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）；培养35d的胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus，俗称“钾细菌”），该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时，荚膜丰厚；培养1216h 的水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae ），黏质赛氏杆菌（Serratia marcescens ）或荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens ）斜面

15、菌种；培养1216h的枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）以及荧光假单胞菌（Pseudomonas Fluorescens）。2、染色液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液；Tyler法染色液、用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液、黑素、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CUSO4水溶液；硝酸银染色液（包括A液和B液，）、Leifson 染色液；香柏油、二甲苯。七、实验用品小试管（75mm×10mm）、烧杯（300mL）、载玻片、凹载玻片、盖玻片、滴管、废液缸、玻片搁架、接种环、擦镜纸、吸水纸

16、、镊子、记号笔、洗瓶、凡士林、无菌水、水浴锅、生物显微镜等。 八、实验方法（一）细菌芽孢染色1、改良的Schaeffer和Fulton氏染色法制备菌液：加12滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取23环菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。为什么要制成浓稠的菌液？加染色液：加5%孔雀绿水溶液23滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。加热：将此试管浸于沸水浴，加热1520min。涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。固定：将涂片通过酒精灯火焰3次。脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。复染：加番红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用

17、吸水纸吸干。镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察。结果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。2、Schaeffer与Fulton氏染色法涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过23次。染色：加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后，将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持1520min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。加热时温度可否太高？水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。复染：用番红液染色5min。水洗、晾干或吸干。镜检：先低倍、再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体

18、的形态。结果：芽孢呈绿色，菌体为红色。（二）细菌荚膜染色细菌荚膜染色方法很多，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。1、负染色法制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取23环菌体放入水滴中混匀并涂布。干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。为什么不能在火焰上方烘干？染色：在涂面上加复红染色液染色23min。水洗：用水洗去复红染液。干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。镜检：先低倍镜，再高倍

19、镜观察。结果：背景灰色，菌体红色，荚膜无色透明。2、湿墨水法制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑23环菌体与其充分混合均匀。加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。加盖玻片时勿留气泡，以免影响观察。镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。结果，背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。3、干墨水法制菌液：加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑23环胶质芽胞杆菌，与葡萄糖液充分混合，再加1环墨水，充分混匀。为什么加6%葡萄糖液？制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散开，然后以30度角，

20、迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜。干燥：空气中自然干燥。固定：用甲醇浸没涂片，固定1min，立即倾去甲醇。干燥：在酒精灯上方，用文火干燥。染色：用甲基紫染12min。水洗：用自来水轻洗，自然干燥。镜检：先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。4、Tyler法涂片：按常规法涂片，可挑23环菌体与水充分混合，并将黏稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大。干燥：在空气中自然干燥。染色：用Tyler染色液染57min。脱色：用20%CUCO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度，冲洗2遍即可。用吸水纸吸干，并立即加12滴香柏油于涂片处，以防止CUCO4结

21、晶的形成。为什么是用20%CUCO4脱色，而不是用水洗脱色？镜检：先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。（三）细菌鞭毛染色1、镀银法染色清洗玻片选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重迭，应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中，洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒，煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡56天。浓洗液的成分是：重铬酸钾60g ,浓硫酸460mL ,水300mL；配制方法是：重铬酸钾溶解在温水中，冷却后再徐徐加入浓硫酸。使用前取出玻片，用自来水冲

22、去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。菌液的制备及制片 菌龄较老的细菌容易脱落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上连续移接35代，要求培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱中培养1216h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液35环，移至盛有12mL无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37恒温箱中静置10min。放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落，让幼龄菌的鞭毛松展开。然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。让涂片自然干燥。用于鞭毛染色

23、的菌体也可用半固体培养基培养。方法是将0.30.4%的琼脂牛肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中，待凝固后，在平板中央点接活化了34代的细菌，恒温培养1216h后，取扩散菌落边缘的菌体制作涂片。染色滴加A液，染46min。用蒸馏水充分洗净A液。用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持0.51min，加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区。用蒸馏水洗，自然干燥。镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。2、改良Leifson染色法清洗玻片法同前。配制染料：见附录2-9。染料配好后要过滤1520次后染色效果才好。菌液的制备及涂片。菌液的

24、制备同前。用记号笔在洁净的玻片上划分34个相等的区域。放1滴菌液于第一个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端，并用滤纸吸去多余的菌液。干燥在空气中自然干燥。染色加染色液于第一区，使染料覆盖涂片。隔数min 后再将染料加入第二区，依此类推，相隔时间可自行决定，其目的是确定最合适的染色时间，而且节约材料。水洗：在没有倾去染料的情况下，就用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀。干燥：自然干燥。镜检：先低倍观察，再高倍观察，最后再用油镜观察，观察时要多找一些视野，不要指望在12个视野中就能看到细菌的鞭毛。结果：菌体和鞭毛均染成红色。（四）细菌的运动性观察1、制备菌液：在幼龄菌斜面上，滴加34

25、mL无菌水，制成轻度混浊的菌悬液。2、涂凡士林：取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林。3、滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片的中央，并用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。4、盖凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后翻转凹玻片，使菌液正好悬在凹槽的中央，再用铅笔或火柴棒轻轻压盖玻片，使玻片四周边缘闭合，以防菌液干燥（图示）。若制水浸片，在载玻片上滴加一滴菌液，盖上盖玻片后即可置显微镜下观察。5、镜检：先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中央高倍镜观察。由于菌体是透明的，镜检

26、时 可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动，还是分子作布朗运动，前者在视野下可见细菌自一处游动至它处，而后者仅在原处左右摆动。细菌的运动速度依菌种不同而异，应仔细观察。结果：有鞭毛的枯草杆菌和假单胞菌可看到活跃的活动，而无鞭毛的金黄色葡萄球菌不运动。九、作业与思考题（一）绘图：绘出所用材料的芽孢和菌体的形态图；绘出Bacillus mucilaginosus的荚膜和菌体形态图，并注明各部位的名称；绘出鞭毛菌的形态图；绘出所看到的细菌的形态图，并用箭头表示其运动方向。（二）思考题1、用简单染色法能否观察到细菌的芽孢？2、若涂片中观察到的只是大量游离芽胞，很少

27、看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？3、通过荚膜染色法染色后，为什么被包在荚膜里的菌体着色而荚膜不着色？4、用鞭毛染色法准确鉴定一株细菌是否具有鞭毛，要注意哪些环节？5、悬滴法中，为什么要涂凡士林？为什么加的菌液不能太多？如果发现显微镜视野内大量细菌向一个方向流动，你认为是什么原因造成的？实验三十七 微生物细胞形态及菌落特征观察一、实验目的与要求1、学习制水浸片观察蓝细菌的形态；2、学习用放线菌的玻璃纸培养物观察放线菌的个体形态；3、 学习插片培养法观察放线菌形态；4、 学习放线菌的印片染色法；5、 学习自制水浸片观察霉菌的形态；6、 学习接合孢子的培养和观察方法；7、 学习酵母菌子囊孢

28、子的培养及观察方法；8、 学习压片法观察伞菌的担子和担孢子的形态；10、学习观察衣藻和水绵的形态；11、掌握四大类微生物的菌落特征；初步掌握从菌落特征识别四大类微生物的方法。二、重点与难点1、区分和识别四大类微生物的菌落特征和个体形态上有哪些相同点和不同点？为什么？2、运用学到的理论知识解释从微生物菌落形态区分四大类微生物有哪些意义？三、教学方法与手段本次实验课主要采取讲授法和演示法进行教学。实验过程中1-10项实验内容会按照学生分组情况调整各小组每个实验进行的先后顺序。四、实验内容1、 蓝细菌的观察；2、 用玻璃纸琼脂平板透析培养法观察放线菌形态；3、 用插片培养法观察放线菌形态；4、 放线

29、菌的印片染色法；5、 霉菌水浸标本片的制备与观察；6、 霉菌接合孢子的培养与观察霉菌接合孢子的培养与观察；7、 酵母菌子囊孢子的培养与观察；8、 伞菌子实体的压片观察；9、 衣藻和水绵的形态观察；10、微生物菌落特征观察微生物菌落特征观察。五、实验原理蓝细菌是光能营养菌，广泛分布于自然界，它们普遍生长在河流、海洋、湖泊和土壤中，并在极端环境中也能生长。部分蓝细菌还具有固定空气中氮素的能力，一些蓝细菌还能与真菌、苔藓、蕨类和种子植物共生。最简单的蓝细菌为杆状或球形的单细胞生物，多数则形成不分枝的丝状体，由许多单个细胞联成一串，并为一共同的胶质鞘套包被。蓝细菌主要进行分裂繁殖，单细胞蓝细菌分裂后形

30、成群体，包围在胶质层内。丝状蓝细菌细胞在鞘内排列成行，通过细胞分裂使菌丝加长，菌丝不分枝，但有时有假分枝。某些丝状蓝细菌能在丝状体中间或顶部产生异形胞，异形胞比营养细胞稍大，具厚壁，两端有极节，只含有叶绿素a，是固氮蓝细菌固氮的场所。另一些蓝细菌可形成由营养细胞膨大、细胞壁加厚的厚垣孢子。在不良环境下，厚垣孢子可处于休眠状态，待环境适宜时，孢子再萌发成新菌丝。放线菌自然生长的个体形态观察，目前多采用玻璃纸琼脂透析培养法。玻璃纸具有半透膜特性，其透光性与载玻片基本相同，采用玻璃纸琼脂平板透析培养，能使放线菌生长在玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取小片，贴放在载玻片上，用显微镜镜检可观察到自然生长的

31、放线菌个体形态。另外，采用插片培养法也能观察放线菌的个体形态。放线菌的孢子丝形状和孢子排列情况是放线菌分类的重要依据，为了不打乱孢子的排列情况，常用印片法进行制片观察。现在，放线菌孢子的排列和孢子的表面形状是用电子显微镜来进行观察的。霉菌的营养体是分枝的丝状体。其个体比细菌和放细菌大得多，分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝中又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片的特点是：细胞不变形，具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间，溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。利用培养的

32、玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态；也可以直接挑取生长在平板中的霉菌菌体制水浸片观察。接合孢子是霉菌的一种有性孢子，由两条不同性别的菌丝特化的配子囊接合而成。有的为同宗配合，有的为异宗配合。根霉和蓝色梨头霉的接合孢子都属于异宗配合，将它们的两种不同性别的菌株分别记为“”和“” ，将“”和“”菌株接种在同一琼脂平板中，经一定时间培养后，即可产生出接合孢子。酵母菌的有性繁殖一般产生子囊孢子。其形成过程为：两营养细胞各伸出一个小突起而相接触，使两个细胞结合起来，而后接触处的细胞溶解，经质配和核配后，形成双倍体核，原来的细胞形成合子。此双倍体细胞可以进行芽殖。在适宜

33、条件下，合子减数分裂，双倍体核分裂成48个单倍体核，核外再围以原生质逐渐形成子囊孢子，子囊孢子包含在由母细胞壁演变而来的子囊即原来的二倍体细胞中。子囊孢子的形成与否及其数量和形状，是鉴定酵母菌的依据之一。将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）从营养丰富的培养基上移植到含有醋酸钠和葡萄糖或棉籽糖的产孢培养基上，于适温下培养，即可诱导其子囊孢子的形成。本实验即以酿酒酵母为材料观察酵母菌的子囊孢子。磨菇的子实体形如伞状，其有性繁殖器担子和担孢子着生在伞盖下面菌褶两边的子实层上，用石蜡切片或者徒手切片法制成玻片标本，可在显微镜下观察到担子和担孢子的形状、颜色及其着生方式等结构。

34、这里介绍一种压片方法，能很容易对伞菌如双孢蘑菇、香菇、平菇及其它常见野生菇类的子实层进行较为细致的显微镜观察。衣藻是一种单细胞的藻类，水绵是一种丝状绿藻，它们在自然界里分布广泛、在池塘水域和土壤中都有存在。制水浸片在显微镜下可看到它们的形态。区分和识别各大类微生物通常包括菌落特征和个体形态的观察。由于微生物个体形态结构、分裂方式、运动能力、生理特征以及产生色素等能力的不同，因而在固体培养基上生长的菌落各有特点。微生物的个体形态是菌落特征的基础，而菌落特征又是个体形态的集中反应。每一大类微生物都有其独特的细胞形态，故它们在一定的培养条件下都有各自的菌落特征，即它们的菌落在形态、大小、色泽、透明度

35、、粘稠度、边缘情况等都有明显的差异。一般根据这些差异就能识别四大类微生物。此法简便快速，在科研和生产中常可采用。六、实验材料1、活材料：满江红鱼腥蓝细菌（Anabaena azollae ）；培养57d 的紫色直丝链霉菌（Streptomyces uiolaceorectus）的斜面菌种、吸水链霉菌“5102”（Streptomyces hygroscopicus var. Yingchengensis（5102）斜面菌种；培养57d的吸水链霉菌“5102”和紫色直丝链霉菌平板培养物；在马铃薯琼脂平板上生长或用玻璃纸透析培养法培养34d 的葡枝根霉（Rhizpus stolonifer）、橘青

36、霉（Penicillum citrinum）、黑曲霉（Aspergillus niger）；葡枝根霉（Rhizopus stolonifer）或蓝色梨头霉（Absidia coerulea）的“”、“”菌株各一支；酿酒酵母（S. cerevisiae）斜面菌种；从栽培场所或野外采集的成熟的伞菌子实体,也可用商品干菇代用；含有衣藻（Clamydomonas sp.）的绿色池塘水、自然水域中的采集或者人工培养的水绵（Spirogyra sp.）；细菌：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；放线菌：灰色链霉菌（Streptomyc

37、es griseus ），紫色直丝链霉菌（Streptomyces violaceorectus ）；酵母菌：酿酒酵母（Saccharomyces cereuisiae），产朊假丝酵母(Candida utilis)；霉菌：桔青霉（Penicillum citrinum）、黑曲霉（Aspergillus niger）等；2、培养基：高氏一号琼脂培养基。马铃薯琼脂培养基、克氏培养基或麦氏培养基的试管斜面、3、试剂：石炭酸复红染色液、乳酸石炭酸棉蓝染色液、50%酒精（V/V）、3%的酸性酒精、美蓝染色液、50g/L的KOH溶液、碘液、新鲜稻草、1%碳酸氢钠溶液、甲基绿。七、实验用品无菌平皿、玻璃纸

38、、9mL无菌水若干支、酒精灯、火柴、接种环、玻璃刮铲、1mL无菌吸管、剪刀、小刀、有凹窝的载玻片、载玻片、盖玻片、解剖针、镊子、眼科镊子、5%甘油、蒸馏水、滴管、玻璃瓶、吸水纸、量杯、天平、pH试纸、试管、玻璃缸、三脚架、石棉网、烧杯、培养皿、药棉、巴氏吸管、放大镜、生物显微镜。八、实验方法（一）蓝细菌的观察用红萍观察蓝细菌的形态。其方法是：在载玻片上加一滴蒸馏水，取红萍叶片一块，放在水滴中，用解剖针将叶片撕开，盖上盖玻片，再用手指压一下，使红萍叶片散开，置显微镜下观察，先用低倍镜，后用高倍镜观察，可见到共生在红萍小叶腹腔中的满江红鱼腥蓝细菌（Anabaena azollae ）。可见到蓝细菌

39、的营养细胞、异形胞、极节和由营养细胞组成的藻殖段。（二）用玻璃纸琼脂平板透析培养法观察放线菌形态1、将玻璃纸剪成培养皿大小，用旧报纸隔层迭好后灭菌。2、将放线菌斜面菌种制成103的孢子悬液。3、将高氏一号琼脂培养基熔化后在火焰旁倒入无菌培养皿内，每皿倒15mL左右，待培养基凝固后，在无菌操作下用镊子将无菌玻璃纸覆盖在琼脂平板上即制成玻璃纸琼脂平板培养基。4、分别用1mL无菌吸管取0.2mL吸水链霉菌“5102”孢子悬液、紫色直丝链霉菌孢子悬液分别滴加在两个玻璃纸琼脂平板培养基上，并用无菌玻璃刮铲涂抹均匀。5、将接种的玻璃纸琼脂平板置2830下培养。6、在培养至3d ，5d ，7d 时，从温室中

40、取出平皿。在无菌环境下。打开培养皿，用无菌镊子将玻璃纸与培养基分离，用无菌剪刀取小片置于载玻片上用显微镜观察。可见到放线菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。（三）放线菌的插片培养法放线菌的插片培养是将放线菌菌种制成孢子悬液，浓度以102103为好，取0.2mL放在适合放线菌生长的平板培养基上，用玻璃刮铲涂布均匀，然后将灭过菌的盖玻片斜插入固体培养基中，置2832下培养，35d 后取出盖玻片放在载玻片上镜检，可见自然生长的放线菌个体形态。可见到放线菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。（四）放线菌的印片染色法1、制片：取干净载玻片一块，用小刀切取放细菌培养体一块，应带培养基切下，放在载玻片上，用另一载玻片

41、对准菌块的气生菌丝轻轻按压，然后将载玻片垂直拿起。注意不要使培养体在玻片上滑动，否则会打乱孢子丝的自然形态。2、固定：将印有放线菌的涂面朝上，通过酒精灯火焰23次加热固定。3、染色：用石炭酸复红染色液染色1min。4、水洗，晾干。可否用吸水纸吸干?5、镜检：先用低倍镜，后用高倍镜，最后用油镜观察，可见孢子丝、孢子的形态及孢子排列情况。（五）霉菌水浸片标本的制备与观察1、 制水浸片观察法在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液或蒸馏水，用解剖针从生长有霉菌的平板中挑取少量带有孢子的霉菌菌丝，用50%的乙醇浸润，再用蒸馏水将浸过的菌丝洗一下，然后放入载玻片上的液滴中，仔细地用解剖针将菌丝分散开来。盖

42、上盖玻片，勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片，先用低倍镜观察，必要时转换高倍镜镜检，并记录观察结果。2、玻璃纸透析培养观察法 玻璃纸的选择与处理：要选择能够允许营养物质透过的玻璃纸。也可收集商品包装用的玻璃纸，加水煮沸，然后用冷水冲洗。经此处理后的玻璃纸若变硬，必定是不可用的，只有那些软的可用。将那些可用的玻璃纸剪成适当大小，用水浸湿后，夹于旧报纸中，然后一起放入平皿内121灭菌30min备用。 菌种的培养：按无菌操作法，倒平板，冷凝后用灭菌的镊子夹取无菌玻璃纸贴附于平板上，再用接种环沾取少许霉菌孢子，在玻璃纸上方轻轻抖落于纸上。然后将平板置2830下培养35天，曲霉和青霉即可在玻璃纸上长出单个

43、菌落（根霉的气生性强，形成的菌落铺满整个平板）。 制片与观察：剪取用玻璃纸透析法培养34d 后长有菌丝和孢子的玻璃纸一小块，先放在50%乙醇中浸一下，洗掉脱落下来的孢子，并赶走菌体上的气泡，然后正面向上贴附于干净载玻片上，滴加12滴乳酸石炭酸棉蓝液，小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡，不要移动盖玻片，以免搞乱菌丝。标本片制好后，先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。注意观察菌丝有无隔膜，有无假根、足细胞等特殊形态的菌丝。注意其无性繁殖器官的形状和构造，孢子着生的方式和孢子的形态、大小等。（六）霉菌接合孢子的培养与观察1、倒平板：按无菌操作法，将已熔化的琼脂培养基倒入无菌平板中，待凝固后接种。2、接

44、种：用接种环挑取葡枝根霉“”菌株的菌丝少许，在平板左侧点接一下，烧环后，再挑取“”菌株的菌丝在平板右侧点接一下。为什么在左右两侧点接菌种？注意：两菌之间应有一定距离，菌种在接合培养前要活化23代。3、培养：将接种好的平板置2830下培养5d 后观察。4、制片与观察：取一块干净载玻片，滴加1滴蒸馏水或乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针挑取“”、“”菌丝间的菌丝少许,为什么是取两菌落间的菌丝来进行观察？用50%酒精浸润并用水洗涤,放于液滴中，小心分散菌丝，加盖盖玻片后先置低倍镜下观察，必要时再转换高倍镜。注意观察不同时期形成的接合孢子，以及接合孢子和配子囊的形状。（七）酵母菌子囊孢子的培养与观察1、子

45、囊孢子的培养：将酿酒酵母用马铃薯培养基活化23代后，转接于克氏或麦氏斜面培养基上，于25培养35d ，即可形成子囊孢子。2、制片与观察：于载玻片上加蒸馏水一滴，取子囊孢子培养体少许放入水滴中制成涂片，干燥固定后用石炭酸复红染色液加热染色510min,不能沸腾，倾去染液，用酸性酒精冲洗3060s脱色，再用水洗去酒精，最后加美蓝染色液染色，510s 后用水洗去染液，用吸水纸吸干后置显微镜下镜检。子囊孢子为红色，菌体为青色。亦可不经染色直接制水浸片观察。水浸片中的酵母菌的子囊为圆形大细胞，内有24个圆形的小细胞即为子囊孢子。（八）伞菌子实体的压片观察1、取载玻片和盖玻片数块，用干净纱布擦净后，用镊子

46、夹住分别在酒精灯火焰上来回通过几次，以进一步烧去玻片上所沾污的有机物,注意：盖玻片很易烧碎，一定不要久烤。2、在冷却的载玻片中央加一小滴蒸馏水,如果选用干标本作观察材料，可用以50g/L的KOH溶液代替蒸馏水，能使干缩的担子及担孢子等组织结构复原到原来大小。再用尖头镊子在菌褶中间部分夹取米粒大小一块褶片置于载玻片的蒸馏水或KOH溶液中，并用解剖针将褶片分散,若用干菇，则要待稍浸润后再进行分散。3、取盖玻片一块先使一边浸在载玻片上的溶液中，慢慢将盖玻片加盖在分散的褶片上，尽量不要把气泡封闭在盖玻片内。4、用铅笔上的橡皮头挤压或轻轻敲打盖玻片,注意不要把盖玻片敲碎。至观察材料呈极薄的膜状分散后，即

47、可置于显微镜下，先低倍镜后高倍镜观察。如果光线太强，可以通过升降聚光器或调节光圈，减弱视野亮度，便可清楚地看到担子、担孢子或其它结构的大小、形态和排列状态。（九）衣藻和水绵的形态观察1、衣藻的形态观察到绿色池塘边取少量水，采回后镜检有无衣藻，若有，把它培养在自然水里。如果用自来水，必须静置12d ，让水里氯气散失，以免影响衣藻的生活。用滴管吸一滴含有衣藻的水，放在洁净的载玻片上，盖上盖玻片，放在低倍镜下观察。若能看到一个绿色、椭圆形的细胞活泼地在水里运动，可初步判断是衣藻，再换高倍镜观察。然后加一滴碘液或稀的碘酒，用吸水纸吸去一部分水，再用高倍镜观察。这时衣藻被杀死，染上了颜色，能清楚地看到它

48、的细胞结构。衣藻是单细胞生物，外面由细胞壁包围着，里面有杯状的叶绿体，叶绿体中有一个蛋白核，前端还生着两条染上黄褐色的鞭毛和一个红色的眼点。2、水绵的培养和观察水绵是一种多细胞的绿藻，由于它的细胞外有胶质，手触摸时有滑腻感。在静水池塘里采取漂浮着的像丝绵那样的绿色物，用手摸一摸，若有点滑腻，这便是水绵。采集时不要把刚毛藻和丝藻错认为水绵。虽然这三种绿色藻类都呈丝状，但刚毛藻是分枝的，丝藻只有2cm左右长，且一端附着在水里的砖头或木头上，像长了一层绿色的毛。如果要培养水绵，可以用硝酸钾、硫酸镁和磷酸二氢钾各1g，溶解在1L水里，再加入3g碳酸钙，配制成培养液。把上述培养液加两倍水稀释，用来培养水

49、绵，可以加速细胞的发育和分裂。观察水绵时，用镊子取少量亮绿的水绵，放在载玻片上的水滴里，用解剖针轻轻地分开水绵的细丝，盖上盖玻片，用显微镜观察，就能看到由许多圆筒状细胞组成的藻丝。细胞里有螺旋盘绕的带状叶绿体。叶绿体上有一列蛋白核。水绵在培养液里培养几天后，再移到盛有天然水的玻璃缸里。如果用自来水，要先把水放在缸里晒12d ，让水里的氯气散出。把缸里的水绵暴露在日光下，45d 以后可以得到接合生殖。春季，在静水池塘里也容易采集到接合生殖材料，水绵生长时大都呈亮绿色，形成接合孢子后转变成黄棕色。把接合生殖的水绵放在载玻片上的水滴中，盖上盖玻片，用显微镜观察，可以看到并排的两条水绵藻丝相对的两细胞

50、生出突起，突起接触处的细胞壁消失，一个细胞里的原生质流到相对的一个细胞里去，形成合子。（十）微生物菌落特征观察1、已知菌落的观察与识别 细菌和酵母菌菌落的观察和识别 细菌和酵母菌都是单细胞微生物，菌落有共同的特征，较湿润、光滑、透明、易挑起，菌落的正反面、边缘和中央颜色一致，质地较均匀。但两者也有区别，细菌的菌落较小、较薄、较透明、较湿润、颜色多样，较有“细腻”感。有鞭毛的细菌其菌落较扁平、边缘不规则。有芽孢的细菌菌落粗糙、多皱、不透明。酵母的菌落比细菌的大、厚，外观较稠、较不透明。 放线菌和霉菌菌落的观察和识别 放线菌和霉菌的细胞都呈丝状，在固体培养基上都有基内菌丝即营养菌丝和气生菌丝的分化

51、，因此它们的菌落外观干燥、不透明，呈蛛丝状或绒毛状，菌落与培养基结合紧密不易挑起。菌丝、孢子常分泌不同色素，故使菌落的正反面、中央和边缘表现不同的颜色。两者也有区别：放线菌比霉菌菌丝细，生长后期分化的孢子丝有大量的孢子，因而它的菌落比霉菌小而紧密，表面呈干粉状。霉菌的菌丝比放线菌粗长，菌丝生长快而松散，所以菌落大而疏松。按照“菌落形态观察记录表”的项目，认真观察并比较四大类微生物的异同。2、 认识未知菌 认真观察各编号的未知菌落的各项特征，运用区别各大类微生物的原则，分别归入相应的大类中，并将鉴别的结果填入“微生物菌落形态观察记录表”中。微生物菌落形态参见图示。九、作业与思考题（一）绘图：1、

52、绘出所观察到的红萍鱼腥蓝细菌的形态图，注意观察细胞排列及细胞形状，异形胞的结构，着生部位以及介于两个异形胞之间由一串营养细胞组成的藻殖段；2、绘出吸水链霉菌“5102”和紫色直丝链霉菌自然生长的个体形态图；3、绘出吸水链霉菌“5102”和紫色直丝链霉菌的孢子丝和孢子的形态图；4、给出根霉、青霉、曲霉的个体形态图，并注明各部位名称；5、绘出葡枝根霉接合孢子形态图，并注明配子囊、接合孢子的名称；6、绘出酵母菌的子囊、子囊孢子形态图并注明各部位的名称；7、绘出伞菌担孢子着生在担子上的形态图，并注明各部位的名称；8、绘出衣藻的形态图，并注明各部位的名称；9、绘一条水绵的形态图，并画出细胞中叶绿体的轮廊

53、；10、画一个放大的水绵细胞，并注明各单位名称；11、绘出水绵的接合生殖图；12、将各菌落的观察结果记入下表中，并报告各编号菌落的观察、识别结果。（二）思考题1、为什么在培养基上放了玻璃纸后，放线菌仍能生长？2、印片法成败关键在哪里？3、四大类微生物的菌落形态有何异同？为什么？4、从微生物菌落形态区分四大类微生物有何意义？ 微生物菌落形态观察记录表大类菌名或编号大小（mm）形成方式表面形态边缘干湿颜色光泽厚度透明度细菌放线菌酵母菌霉菌123实验三十八 培养基制作、灭菌与无菌操作接种技术一、实验目的与要求1、学习细菌、放线菌及真菌常规培养基的制备方法；2、学习微生物操作中常用的灭菌与消毒方法；3

54、、掌握高压蒸汽灭菌锅的灭菌原理及使用方法；4、学习并掌握棉塞制作及常用器皿包扎的方法；5、学习并掌握无菌操作接种技术要点。二、重点与难点 1、高氏一号培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基分别属于哪种类型的培养基？分别适合培养哪种微生物？2、使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时必须排尽锅内的冷空气，为什么？3、掌握无菌操作与斜面接种技术要点。三、教学方法与手段本次实验课主要采取讲授法和演示法,辅以视频影象资料进行教学。实验过程中1-7项实验内容会按照学生分组情况调整各小组每个实验进行的先后顺序。四、实验内容1、 牛肉膏蛋白胨培养基的制备；2、 高氏一号合成培养基的制备；3、 马铃薯蔗糖琼脂培养基的制备；4、 棉塞的制作及玻璃器皿的包扎；5、 常用灭菌和消毒方法简介；6、 用高压蒸汽灭菌锅对培养基和器皿进行灭菌；7、 无菌操作与斜面接种技术。五、实验材料1、药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaC1、10%NaOH溶液、10%盐酸溶液；可溶性淀粉、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KNO3、NaCI、FeSO4·7H2O、琼脂、10%NaOH 溶液、10%盐酸。2、材料：新鲜马铃薯、蔗糖或葡萄糖。六、实验用品 小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、100mL刻度搪瓷杯、玻棒、pH试纸、分装漏斗、棉花、棉皮圈、天平、100 mL烧杯、标签纸、电炉、菜板、小刀、纱布、18mm&