流程——永诺生物

1、6张胶1. 蛋白质样品的CyDye荧光标记荧光标记使用CyDye DIGE Flour（minimal Dye）Labelling Kit进行，所有涉及Dye的操作在避光条件下进行。1） 取出20保存的CyDye试剂盒，室温放置58分钟以防开盖时凝露，12000g离心1分钟；2） 按照试剂盒说明：每个原始包装管中各有5nmol的粉状Dye，加入5l无水DMF后震荡30秒、12000g离心30秒，即成1nmol/l的dye stock solution；3） 按照CyDye最小标记法原则，即400pmol的Dye可以标记50g的蛋白，根据实验设计计算出所需各种Dye的总量（Cy2、Cy3、Cy5

2、各需2.4nmol）；4） 以dye stock solution : 无水DMF2 : 3的比例，将dye stock solution稀释成working dye solution (400pmol/l)，即working dye solution 2.4ul加入无水DMF 3.6l，震荡30秒、12000g离心30秒；（注意：各种dye的stock solution和working solution未用完者必须密封后储存于20，stock solution最多可保存两个月，working solution配制好后必须在两周内用完。）；5） 在每个准备进行标记的样品管中，根据实验设计加入1

3、l Cy3或Cy5的working dye solution，在pool管中加入6l的Cy2 working dye solution，将所有样品管震荡30秒、12000g离心30秒；6） 荧光标记反应在冰浴、避光条件下进行30分钟；7） 在每个样品管中加入1l Lysine solution，在pool管中加入6l Lysine solution，震荡30秒、12000g离心30秒后，在冰浴中避光静置10分钟以终止标记反应；8） 按照实验设计，先将标记好的各个样品混合，然后在每个混合的样品中加入50g Cy2标记的pool样品，震荡30秒、12000g离心30秒后80冻存或直接进行双向电泳；

4、 2-DE和2D-DIGE的第一向等电聚焦电泳（IEF）准备1） IPG胶条的选择：根据先期预实验结果，本研究选择pH47，24cm的IPG胶条对样品的蛋白质进行等电聚焦分离；2） 准备各种用于不同检测手段的足量蛋白质样品：Deep purple染色：500g/样品（按前述荧光标记准备中的pool样品）2D-DIGE荧光检测：150g/样品（Cy2、Cy3、Cy5标记的混合样品）3） 配制Rehydration buffer：每100ul的Rehydration stock buffer中加入DTT 2.8mg、IPG buffer（pH4-7）2.3l、Bromophenol blue so

5、lution (1%) 0.92l（用于2D-DIGE时IPG buffer用量为4.6l）；4） 在每个样品管中加入Rehydration buffer 100l；5） 使用Rehydration stock buffer将每个样品的体积补足至460l，这样每460ul样品中就含有DTT 2.8mg、IPG buffer 0.5%（用于2D-DIGE时为1%）、Bromophenol blue 0.002%，达到进行IEF的要求；6） 所有样品管使用12000g离心8分钟以沉淀可能存在的不溶物，取450l准备IEF上样。 第一向IEF（使用再水化上样法）1） 检查等电聚焦仪状况，准备洁净的胶

6、条槽（IPG strip holder）以及胶条覆盖液（IPG strip cover fluid）；2） 将上述制备的含蛋白质样品的450l Rehydration buffer均匀的涂布在胶条槽两电极之间，避免产生间断和气泡；3） 取出20保存的IPG干胶条（IPG strip pH4-7），使用镊子从正极（酸性端）开始小心的撕掉保护膜，将IPG胶条的胶面向下，并将其正极端顶至胶条槽正极端，缓缓的把整个胶条放入胶条槽中，检查样品溶液在胶下是否均匀及有无气泡；4） 每个IPG胶条上均匀覆盖1ml左右的IPG strip cover fluid以防电泳时水分蒸发；5） 盖上胶条槽盖，再次检查上

7、样情况，并核对样品与相应的IPG胶条编号，（对荧光标记样品的IEF需要加避光罩进行）；6） IEF程序设置： Current: 50A/stripStep 1: 30V, 12h, step-n-holdStep 2: 500V, 1h, step-n-holdStep 3: 1000V, 1h, step-n-holdStep 4: 8000V, 12h, step-n-holdTotal: 85000Vh7） IEF完成后， IPG胶条80冻存或直接进行第二向电泳；8） 及时清洗胶条槽以免残留蛋白质附着于槽内影响后续使用。 2-DE和2D-DIGE第二向SDS-PAGE的凝胶制备1） 准备

8、洁净的玻璃板（2D-DIGE使用特制的低荧光玻璃板）、灌胶槽、隔板、无尘擦拭纸，Bind-Silane solution等试剂；2） 如需进行后续Spot handling workstation处理的凝胶，其玻璃背板需要进行硅烷化处理，使凝胶粘附在玻璃背板上，过程如下： 在玻璃背板内面粘贴workstation识别凝胶的圆点内标（Internal Reference，IR） 使用无尘擦拭纸蘸少许无水乙醇，彻底擦拭玻璃背板； 待乙醇挥发后，取Bind-Silane solution 3.5ml均匀涂布在背板上； 涂好的背板在通风柜中静置1.5 2小时待其彻底干燥； 使用超纯水微微湿润的无尘擦拭

9、纸，轻轻擦拭玻璃背板以去除可能存在的尘屑等； 待水分彻底干燥后，将背板和前板对齐装好。3） 将玻璃板、隔板依次放进灌胶槽，安装好堵漏、固定螺丝等以确保不会发生渗漏，将灌胶槽放置水平面上等待灌胶；4） 进行双向电泳，常规选择12.5%的SDS-PAGE胶，按照前述配方首先将Monomer stock solution、Tris-HCl、SDS、Milli-Q水混合，避光条件下在磁力搅拌器上边搅拌边使用负压抽气15分钟，再加入APS和TEMED搅拌混匀；5） 将混合均匀的凝胶溶液缓缓注入灌胶槽，液面高度至玻璃前板上缘，避免产生气泡；6） 在胶液面上缓缓加入水饱和正丁醇（Water saturate

10、d butanol）将胶面压平，灌好的凝胶在室温静置10 12个小时待其充分聚合；7） 为慎重起见，进行第二向电泳前，先观察凝胶是否聚合均匀、胶面是否平整、有无气泡等，再开始准备下一步实验。 IPG胶条的平衡1） 分别配制每10ml含有DTT 100mg或IAA 250mg的SDS equilibration buffer；2） 第一步平衡，在每个装IPG胶条的平衡管中加入10ml含DTT的SDS equilibration buffer，在轨道摇床上缓慢摇动平衡15 min；3） 第二步平衡，在每个装IPG胶条的平衡管中加入10ml含IAA的SDS equilibration buffer，

11、在轨道摇床上缓慢摇动平衡15 min。 2-DE和2D-DIGE的第二向SDS-PAGE1） 配制SDS-PAGE电泳缓冲液：上槽 (cathode)：SDS electrophoresis buffer (10×) 160ml稀释至800ml，下槽 (anode)：SDS electrophoresis buffer (10×) 455ml稀释至4550ml；2） 使用上槽电泳缓冲液配制琼脂糖封胶液（Agarose sealant、Upper chamber agarose sealant）并加热熔解；3） 用纯水清洗掉SDS-PAGE凝胶玻璃板上的碎胶和胶面上的水饱和正

12、丁醇，加入上槽电泳缓冲液以平衡胶面；4） 准备4mm×8mm大小的滤纸片，在上面滴加标准分子量Marker 10l和Upper chamber agarose sealant 10l后备用；5） 首先将下槽电泳缓冲液约3500ml倒入电泳槽，打开电泳液循环泵和水浴循环泵，将水浴循环温度设置为10。6） 倒去SDS-PAGE凝胶面上的电泳缓冲液，用滤纸彻底吸干，将温热的Agarose sealant注入胶面上缘空隙直至填满；7） 平衡好的IPG胶条在上槽电泳缓冲液中略微漂洗一下，剪去两端多余的支持膜，在无尘擦拭纸上沾去多余缓冲液后，水平放置在SDS-PAGE凝胶上缘并贴紧玻璃背板，用洁

13、净的尺子将胶条压入Agarose sealant，使IPG胶条水平的附在SDS-PAGE凝胶上缘，如有气泡需挤出；8） 在IPG胶条旁插入带有标准分子量Marker的滤纸片后，再次用温热的Agarose sealant将胶面上缘因放置IPG胶条而产生的空隙填满；9） 将放置好IPG胶条的SDS-PAGE凝胶板依次插入电泳槽，待Agarose sealant冷却凝固后，将上槽（Upper chamber）湿润后水平的压进电泳槽内；10） 用Upper chamber agarose sealant将上槽与凝胶板的接缝处填充，待凝固后即可较好的防止上、下槽间的渗漏；11） 缓缓加入少量上槽电泳缓冲

14、液，确认无渗漏后，分别加入剩余的上、下槽缓冲液，使上、下槽缓冲液处于电泳槽标定刻度间的同一水平面；12） 接好电泳槽电极，检查无误后打开电泳仪电源，SDS-PAGE程序设置：第一步：2W/gel，50分钟，第二步：17W/gel，直至胶内电泳指示剂（Bromophenol blue）跑出凝胶下缘；（注：2D-DIGE凝胶的电泳在避光条件下进行）13） 二向电泳结束后，小心的从电泳槽中取出凝胶板，标记和记录与IPG条相应的二向胶样品编号，需进行染色的凝胶使用专用的尺子将玻璃前板撬开、移去，纯水冲洗掉胶面残留的电泳缓冲液和碎胶后，立即使用染色的固定步骤固定凝胶内的蛋白质斑点；14） 2D-DIGE

15、结束后无需撬开玻璃板，仅冲洗掉板表面的电泳缓冲液即可，尽可能马上进行图像扫描，若无法立即扫描需将玻璃板密封后4储存以尽量减缓蛋白质斑点在胶内的扩散。2.4 2-DE凝胶的检测和图像获取 试剂及耗材硝酸银（AgNO3）、硫代硫酸钠（Na2S2O3）、碳酸钠（Na2CO3）、碳酸氢钠（NaHCO3）购自美国Sigma公司，磷酸（H3PO4）、冰醋酸（Glacial acetic acid）购自德国Merck公司，甲醇（Methanol）为美国Fisher公司产品，深紫荧光染料（Deep purple）为瑞典Amersham Bioscience公司产品。 仪器、设备及软件Typhoon9400型多

16、功能激光扫描仪及附件，ImageQuant TL V2003.3软件（瑞典 Amersham Biosciences）；标准灰度尺（美国 Kodak）；其余仪器、设备同前。 2-DE凝胶的深紫（Deep Purple）荧光染色1） 固定：凝胶在固定液（Methanol 10%，Glacial acetic acid 7.5%）中固定过夜；2） 漂洗：凝胶在漂洗液1（NaHCO3 35mM，Na2CO3 300mM）中漂洗30分钟；3） 染色：凝胶在染色液（Deep Purple 0.5%）中避光染色1小时；4） 漂洗：凝胶在漂洗液2（Glacial acetic acid 7.5%）中避光漂洗

17、2次，每次15分钟；5） 凝胶可在漂洗液2中，4条件下避光储存。1） 图像旋转：按常规要求，如图2-1，双向电泳图像的左上方为低pH值、高分子量，右下方为高pH值、低分子量；.4.7 DIGE凝胶、Deep Purple荧光染色凝胶的扫描1） 使用纯水、30%乙醇和无尘擦拭纸清洁Typhoon9400型多功能激光扫描仪的扫描平面；2） 将DALT six专用导向支架放入扫描平面，凝胶板固定在两个支架之间，荧光染色凝胶（去掉玻璃前板）的放置方法同考染图像扫描的凝胶放置方法；3） 打开扫描仪预热30分钟，启动扫描控制软件（Typhoon Scanner Control V5.0）；4） DIGE、

18、Deep Purple荧光染色凝胶的扫描参数设置：图像获取模式（Acquisition Mode）：荧光（Fluorescence）设置（Setup ）：Cy2：Blue laser（488nm），Emission Filter：520BPCy3：Green laser（532nm），Emission Filter：580BPCy5：Red laser（633nm），Emission Filter：670BPPurple：Green laser（532nm），Emission Filter：610BP初始光电倍增管电压（PMT）均设置为450，Tray：DIGE Ettan DALT，Pixe

19、l Size：预览时采用500microns，图像获取时采用100microns；5） DIGE凝胶扫描时，须选择聚焦平面（Focal Plane）+3mm，并选取DIGE file Naming Format；6） 荧光图像扫描获取后，使用ImageQuant软件检测凝胶图像的信号最大强度（Max intensity），按照图像分析要求：信号最大强度值处在60000 90000之间的图像才能进行相对精确的定量分析，因此需不断调整PMT值重复进行扫描，直至所有凝胶图像的检测值符合该要求为止；7） 图像的同步裁切：使用ImageQuant软件的同步裁切功能去掉所有原始扫描图像中的玻璃板边框等图谱

20、分析干扰因素，仅保存凝胶图谱区域。2.5 2-DE、DIGE凝胶图谱的分析 2D-DIGE和Deep purple荧光染色凝胶图谱的DeCyder V6.0软件分析1） 启动DeCyder软件，首先打开图像导入（Image Loader）模块，建立新项目名称，将所有凝胶图像导入软件的内建数据库；2） 打开批处理（Batch Processor）模块，命名新的批处理名称，将导入的凝胶图像添加至batch中，设置估计斑点数目（Estimated no. of spots）为3000，并选择Include in BVA batch list选项；3） 在生物学变化项目设置（BVA item sett

21、ings）中，建立Standard、25K和5K三个文件夹，将凝胶图像分别添加至Standard（Cy2标记）、25K（Cy3或Cy5标记的25K处理组图像）和5K（Cy3或Cy5标记的5K处理组图像）文件夹中；4） 运行Batch Processor程序，软件将自动完成对凝胶图像斑点的识别，并进行DIA和BVA的初步分析，保存结果后退出Batch Processor模块；5） 启动胶内差异分析（Differential In-gel Analysis, DIA）模块，对每一个凝胶图谱的胶内差异图谱进行分析，对斑点的Max slope和Area值进行排序，分析并排除图谱内由于凝胶制备或电泳过程

22、中产生的干扰因素如颗粒污染等； 6） 打开生物学变化分析（Biological Variation Analysis, BVA）模块，首先将所有图谱与Master gel的图谱进行分析，纠正Batch Processor过程中可能出现的错误匹配的斑点；7） 在蛋白质统计（Protein Statistics）选项中设定比较25K和5K处理组的差异，进行Students T-test，使软件重新计算所有蛋白质斑点的平均变化比值（Average Ratio）并对其进行统计分析；8） 在Protein table中选取Average Ratio大于1.5倍的蛋白质斑点，对统计分析有意义的斑点进行逐一分析并确认，对需要进行质谱鉴定的蛋白质斑点标记为Pick；9） 在同步匹配的Deep purple染色的制备胶图谱上标明全自动斑点处理工作站识别凝胶斑点坐标的Picking Reference（Internal Reference，IR），导出Pick List。2.6 实验结果 蛋白质浓度测定1） 先后收集三批培养在10cm培养皿中的神经元总蛋白，经蛋白质纯化后进行蛋白质定量，根据对标准蛋白对照的吸光度值测定，得到的标准曲线如图2-2所示。2） 根据标准曲线（ABS = 8.028 × g +