第4章 蛋白质的共价结构

1、Peptides and Primary Structure of ProteinsOUTLINEw Overview of proteinw Peptidew Determination of the amino acid sequences of proteinsw The amino acid sequence and the function of a proteinw 蛋白质（蛋白质（proteinprotein）是一类最重要的生是一类最重要的生物大分子，在生物体中占有特殊的地位，物大分子，在生物体中占有特殊的地位，与核酸构成细胞内原生质的主要成分。与核酸构成细胞内原生质的主要成分。

2、w 原生质是生命现象的物质基础。原生质是生命现象的物质基础。w4.1 4.1 蛋白质通论蛋白质通论Overview of proteinOverview of proteinw4.1.1 4.1.1 蛋白质的化学组成和分类蛋白质的化学组成和分类w The chemical component and classification of proteinw Chemical component ：w C : 50%C : 50%w H : 7% H : 7%w O : 23% O : 23%w N : 16% N : 16%w S : 0-3% S : 0-3%w other: trace oth

3、er: trace 鲁长豪主编食品检验1987四川科学技术出版社P42The chemical component and classification of proteinw 蛋白质浓度测定：凯氏定氮法的基础：蛋白质浓度测定：凯氏定氮法的基础：w 氮氮 = 16%= 16%w 蛋白质含量蛋白质含量 = = 蛋白氮蛋白氮 6.256.25三聚氰胺三聚氰胺w 单纯蛋白质单纯蛋白质： 仅由氨基酸组成，如核糖核酸酶，肌动蛋白。w 缀合蛋白质缀合蛋白质： 除氨基酸外还有其他化学成分作为结构的一部分。 ( (辅基或配体辅基或配体) )w蛋白质的分类：蛋白质的分类：The chemical compone

4、nt and classification of proteinw 单纯蛋白单纯蛋白还可根据溶解性及其他物理性质进行分类w 缀合蛋白缀合蛋白可根据辅基分类The chemical component and classification of protein按生物功能生物功能分类，如：w 酶酶w 调节蛋白调节蛋白w 转运蛋白转运蛋白w 贮存蛋白贮存蛋白w 结构蛋白等结构蛋白等The chemical component and classification of proteinw 根据形状和溶解度可分为三大类根据形状和溶解度可分为三大类：w )纤维状蛋白质纤维状蛋白质(Fibrous prot

5、ein)w )球状蛋白质球状蛋白质(Globular proteins)w )膜蛋白膜蛋白 (Membrane proteins)w4.1.2 4.1.2 蛋白质的形状和大小蛋白质的形状和大小wThe shape and size of proteinThe shape and size of proteinFibrous proteinFibrous protein w 简单有规律的线性结构、形状呈细棒或纤维状。结构作用。w 胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白等，不溶于稀盐溶液和水。The shape and size of proteinThe shape and size of prot

6、einw globular proteinsglobular proteins ：形状接近球形或椭圆球形，多肽链折叠紧密，疏水的氨基酸侧链位于内部，亲水的在外部，如酶类。w The shape and size of proteinThe shape and size of proteinw Membrane proteinsMembrane proteins ：与细胞的各种膜系统结合而存在，为能与膜内的非极性相相互作用，膜蛋白的疏水氨基酸侧链伸向外部。The shape and size of proteinThe shape and size of proteinw 构象构象和构型构型w

7、Conformation and configurationConformation and configurationw 共同点和区别共同点和区别? ?4.1.3 4.1.3 蛋白质构象和蛋白质构象和 蛋白质结构的组织层次蛋白质结构的组织层次The conformation and Organization level of the protein structurew 构象：构象：指具有相同结构式和相同构型的分子指具有相同结构式和相同构型的分子在空间里可能的多种形态。在空间里可能的多种形态。w 构象的改变不涉及共价键的断裂。构象的改变不涉及共价键的断裂。Conformation and c

8、onfigurationConformation and configurationConformation and configurationConformation and configurationw 构型：构型：在具有相同结构式的立体异构体中，在具有相同结构式的立体异构体中，取代基团在空间的相对取向。取代基团在空间的相对取向。w 不同的构型如果没有共价键的破裂时不能互不同的构型如果没有共价键的破裂时不能互变。变。l Configuration and conformation define the different aspects of the three dimensional s

9、tructure of biomolecules.Configuration defines the spatial (空间的空间的)arrangement of the groups attached to an asymmetric（不对称的）（不对称的） carbon or two double-bonded carbon atoms. Configurational isomers can not be interconverted without breaking one or more covalent bonds.Conformation refers to the numero

10、us possible spatial arrangement of atoms due to free rotations around single bonds. Conformational isomers can be interconverted without breaking covalent bonds.Conformation and configurationConformation and configurationw Protein Primary Structurew Protein Secondary Structurew Protein tertiary Stru

11、cturew Protein Quaternary StructureThe conformation and Organization The conformation and Organization level of the protein structurelevel of the protein structure4.1.4 4.1.4 蛋白质功能的多样性蛋白质功能的多样性Protein functionsw 蛋白质的种类估计在蛋白质的种类估计在10101010 10101212数量级。数量级。w 由由2020种氨基酸组成的种氨基酸组成的2020肽，有肽，有2 210101818种种

12、序序列异构体。列异构体。w 蛋白质的生物功能：蛋白质的生物功能：）催化）催化-酶的作用。酶的作用。）调节）调节-调节蛋白，如胰岛素（激素），调节遗传调节蛋白，如胰岛素（激素），调节遗传信息转录的控制因子。信息转录的控制因子。）转运）转运-转运蛋白，如血红蛋白、血清清蛋白（将转运蛋白，如血红蛋白、血清清蛋白（将脂肪酸从脂肪组织转运到各器官）是通过血流转运物脂肪酸从脂肪组织转运到各器官）是通过血流转运物质的。质的。）贮存）贮存-如卵清蛋白、乳中的酪蛋白、植物种子中如卵清蛋白、乳中的酪蛋白、植物种子中的贮存蛋白等。的贮存蛋白等。）运动）运动-引起肌肉收缩的肌动蛋白，引起细胞运动引起肌肉收缩的肌动蛋白

13、，引起细胞运动的肌动蛋白、肌球蛋白等。的肌动蛋白、肌球蛋白等。Protein functionsProtein functions）结构成分）结构成分-结构蛋白的单体一般聚合成纤维状结构蛋白的单体一般聚合成纤维状如胶原蛋白。如胶原蛋白。）支架作用）支架作用-含有多个不同的组件，在它上面可含有多个不同的组件，在它上面可将多种不同蛋白质组装成一个将多种不同蛋白质组装成一个多蛋白复合体多蛋白复合体，参与，参与对激素和其它信号分子的胞内应答的协调和通讯。对激素和其它信号分子的胞内应答的协调和通讯。 在细胞应答激素和生长因子的复杂途径中起作用。在细胞应答激素和生长因子的复杂途径中起作用。）防御和进攻）防

14、御和进攻-免疫球蛋白（抗体）、血液凝固免疫球蛋白（抗体）、血液凝固蛋白、抗冻蛋白、蛇毒和蜂毒的溶血蛋白、植物毒蛋白、抗冻蛋白、蛇毒和蜂毒的溶血蛋白、植物毒素、细菌毒素。素、细菌毒素。）异常功能蛋白）异常功能蛋白-甜蛋白、节肢弹性蛋白等。甜蛋白、节肢弹性蛋白等。Protein functionsProtein functions 肽是氨基酸的线型聚合物，也称肽链肽是氨基酸的线型聚合物，也称肽链（peptide chainpeptide chain）Amino acids covalently（共价地）（共价地） join one another to form peptides4.2 4.2 肽

15、肽 Peptide Peptide PeptideN-CN-C -C-C-main chain or back bonemain chain or back bone蛋白质中氨基酸的连接方式是肽键，实验证据：蛋白质中氨基酸的连接方式是肽键，实验证据：w 蛋白质分子中游离蛋白质分子中游离-氨基和氨基和-羧基是很少的。羧基是很少的。w 某些人工合成的多肽能被水解蛋白质的蛋白酶某些人工合成的多肽能被水解蛋白质的蛋白酶所水解。所水解。w 双缩脲颜色反应双缩脲颜色反应w X X射线衍射图案射线衍射图案4.2.1 4.2.1 肽和肽键的结构肽和肽键的结构The structure of peptide a

16、nd Peptide bondName of peptide二肽二肽(dipeptide(dipeptide) )寡肽寡肽(oligopeptide(oligopeptide) )多肽多肽(polypeptide)(polypeptide)氨基酸残基氨基酸残基(aminoacid(aminoacid residue) residue)末端氨基末端氨基环状肽环状肽(cyclic peptide)(cyclic peptide)The structure of peptide and Peptide bondThe structure of peptide and Peptide bond w T

17、he peptide chain is directional. An amino acid unit in a peptide chain is called a residue. The end having a free -amino group is called amino-terminal or N-terminal. The end having a free -carboxyl group is called carboxyl-terminal or C-terminal.The structure of peptide and Peptide bond By conventi

18、on, the N-terminal is taken as the beginning of the peptide chain, and put at the left (C-terminal at the right). Ser-Gly-Tyr-Ala-LeuThe structure of peptide and Peptide bond The peptide chain consist of a regularly repeating main chain (or backbone) and the variable side chains of the residues. -N-

19、C -C , N is the amide nitrogen，C is the carbon of amino acid residues，C is carbonyl carbonThe structure of peptide and Peptide bond Peptide bond is the main way for linkage between amino acids in peptides and proteinsPeptide bond is a kind of amide bond, usually denoted (表示表示) by a single bond betwe

20、en carboxyl carbon and amide nitrogen.l Peptide bondThe structure of peptide and Peptide bond 由于酰胺氮上的孤电子对离域与羰基轨道重由于酰胺氮上的孤电子对离域与羰基轨道重叠，因此在酰胺氮和羰基氧之间发生叠，因此在酰胺氮和羰基氧之间发生共振共振相相互作用互作用(resonance interaction) (resonance interaction) CNCaOHCa.The structure of peptide and Peptide bond肽键共振产生几个重要结果：肽键共振产生几个重要结果：

21、w 限制绕肽键的自由旋转限制绕肽键的自由旋转w 组成肽基的组成肽基的4 4个原子和个原子和2 2个相邻的个相邻的C C形成多肽形成多肽主链的主链的酰胺平面酰胺平面(amide plane)(amide plane)，也称肽基平，也称肽基平面或肽平面面或肽平面w C=NC=N键具有约键具有约40%40%双键性质。由于双键性质。由于C CN N具有具有部分双键性质，绕键旋转的能障比较高部分双键性质，绕键旋转的能障比较高, ,保持保持酰胺基处于平面酰胺基处于平面w 肽键具有永久偶极肽键具有永久偶极The structure of peptide and Peptide bond酰胺平面酰胺平面(am

22、ide plane)(amide plane)，限制绕肽键的自由旋转，肽主链的每一氨基酸残基限制绕肽键的自由旋转，肽主链的每一氨基酸残基只保留两个自由度：绕只保留两个自由度：绕N-CN-C 键的旋转和绕键的旋转和绕C C -C-C键的键的旋转旋转w4.2.2 4.2.2 肽的物理和化学性质肽的物理和化学性质w The physical and chemical properties of Peptide短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在偶极离子存在在在pH0pH01414范围内，肽键中的酰胺氢不解范围内，肽键中的酰胺氢不解离离4.2.3 4.2.3

23、 天然存在的活性肽天然存在的活性肽w Biologically active peptidesNHCOCH2NHCOCHNHCOCH3CHCHOHCH2OHCHHNCNHCHCNHCH2CCOCHNHHOCH2NHNHCHCHCH3CH2CH3COOOOCH2CH2SOOH鹅膏覃碱的化学结构鹅膏鹅膏蕈蕈碱是从鬼笔鹅膏中分离出来的一个环状八肽，它能碱是从鬼笔鹅膏中分离出来的一个环状八肽，它能与真核生物的与真核生物的RNA聚合酶聚合酶II牢固结合而抑制酶的活性，因牢固结合而抑制酶的活性，因而使真核生物的而使真核生物的RNA的合成不能进行。的合成不能进行。w +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe

24、-Met-COO-w Met-脑啡肽（脑啡肽（ Met-enkephalin） w+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-w Leu-脑啡肽脑啡肽脑啡肽（脑啡肽（enkephalinenkephalin）在中枢神经系统中形成，）在中枢神经系统中形成，是体内自己产生的一类鸦片剂（是体内自己产生的一类鸦片剂（opiateopiate），是轻），是轻度的情绪调节剂和强力镇痛剂。度的情绪调节剂和强力镇痛剂。wBiologically wactive peptidesCH2OCCH2CHNH2COOHNHHCCONHCH2COOHCH2SHGluCysGlySSCysGluGly(GS

25、SG)(GSH) Biologically active peptidesGlutathioneGlutathione: G-SH and G-S-S-G GluCysGlySH GluCysGlySS GluCysGlyG-SHG-S-S-GoxidationreductionBiologically active peptides Biologically active peptidesl 谷胱甘肽（尤其是肝细胞内的谷胱甘肽）具有非常重要谷胱甘肽（尤其是肝细胞内的谷胱甘肽）具有非常重要的生理作用的生理作用整合解毒作用整合解毒作用，能与某些药物（如扑热息，能与某些药物（如扑热息痛）、毒素（如

26、自由基、重金属）等结合，参与生物转化痛）、毒素（如自由基、重金属）等结合，参与生物转化作用，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄作用，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。出体外。 l 谷胱甘肽的另一主要生理作用是做为体内一种重要的谷胱甘肽的另一主要生理作用是做为体内一种重要的抗抗氧化剂氧化剂，它能够清除掉人体内的自由基，清洁和净化人体，它能够清除掉人体内的自由基，清洁和净化人体内环境污染，从而增进人的身心健康。内环境污染，从而增进人的身心健康。w 蛋白质的共价结构-蛋白质的一级结构-氨基氨基酸序列酸序列w 现在已知约现在已知约200,000200,000个不同蛋白质的氨

27、基酸序个不同蛋白质的氨基酸序列列w 相当一部分使用相当一部分使用SangerSanger法测定的法测定的w 现在大多数是根据编码蛋白质的基因核苷酸现在大多数是根据编码蛋白质的基因核苷酸序列推导出来的。序列推导出来的。4.3 4.3 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定Determination of the amino acid sequences of proteins Determination of the amino acid sequences of proteinsl 蛋白质的氨基酸序列具有重要意义：蛋白质的氨基酸序列具有重要意义： 蛋白质的一级结构决定它的高级结构蛋白质的一级

28、结构决定它的高级结构（第二遗传密码，（第二遗传密码，一个蛋白质分子为获得复杂结构所需的全部信息都含于一个蛋白质分子为获得复杂结构所需的全部信息都含于多肽链的氨基酸序列中）多肽链的氨基酸序列中）Sanger worked out the first amino acid sequence of a peptide (bovine insulin) in 1953. Determination of the amino acid sequences of proteins 蛋白质的氨基酸序列是阐明蛋白质生物活性的分子基础蛋白质的氨基酸序列是阐明蛋白质生物活性的分子基础IAYKPAG 。 。氨基酸序

29、列（一级结构）氨基酸序列（一级结构） 高级结构高级结构 生物活性（功能）生物活性（功能） 4.3.1 4.3.1 蛋白质测序的策略蛋白质测序的策略 Strategy for sequence analysisw 纯度应在纯度应在97%97%以上，同时必须知道它的相对分子以上，同时必须知道它的相对分子质量质量 测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目 拆分蛋白质分子的多肽链（寡聚蛋白则需用变拆分蛋白质分子的多肽链（寡聚蛋白则需用变 性剂性剂 8mol/L8mol/L尿素，尿素，6mol/L6mol/L盐酸胍或高浓度盐处盐酸胍或高浓度盐处理）理） 断开多肽链内的二硫键（用氧化剂或还

30、原剂）断开多肽链内的二硫键（用氧化剂或还原剂） 分析每一条多肽链的氨基酸组成分析每一条多肽链的氨基酸组成Strategy for sequence analysis 鉴定多肽链的鉴定多肽链的N-N-端和端和C-C-端氨基酸残基端氨基酸残基 裂解多肽成较小的片段裂解多肽成较小的片段 测定各肽段的氨基酸序列测定各肽段的氨基酸序列 重建完整多肽链的一级结构重建完整多肽链的一级结构 确定二硫桥的位置确定二硫桥的位置Strategy for sequence analysisw4.3.2 N4.3.2 N末端和末端和w C C末端氨基酸残基的测定末端氨基酸残基的测定w N-

31、 N-末端分析末端分析w 二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB,FDNBDNFB,FDNB）法）法w 丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNSDNS）法（比）法（比DNFBDNFB法灵敏度高法灵敏度高100100倍）倍）w 苯异硫氰酸酯（苯异硫氰酸酯（EdmanEdman试剂）法试剂）法w 氨肽酶法氨肽酶法 C- C-末端分析末端分析w 肼解法肼解法H2NCHCR1NHOCNHOHCCRn-1ONHHCRnCOOHNH2NH2无水100H2NCHCR1NHNH2OH2NHCRnCOOHH2NCHCRn-1NHNH2O+H2NCHCRn-1NHNH2O+苯甲醛二苯基衍生物肼解法肼解法w

32、4.3.3 4.3.3 二硫桥的断裂二硫桥的断裂w 过甲酸氧化法和巯基化合物还原法w4.3.4 4.3.4 氨基酸组成的分析氨基酸组成的分析w 完全水解的氨基酸用氨基酸分析仪测定 Amino acid sequence analyzer : ion-exchange chromatography +color reagents + spectrophotometer Amino Acids Sequence Analysisw4.3.5 4.3.5 多肽链的部分裂解多肽链的部分裂解 和肽段混合物的分离纯化和肽段混合物的分离纯化w 最有效地最有效地EdmanEdman化学降解法一次只能连续降解化

33、学降解法一次只能连续降解几十个残基，因此须先将长的多肽链水解成几十个残基，因此须先将长的多肽链水解成较小的肽段。较小的肽段。 Edman Edman DegradationDegradationw 酶裂解法酶裂解法w 胰蛋白酶胰蛋白酶w 糜蛋白酶糜蛋白酶w 嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶w 胃蛋白酶胃蛋白酶w 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶w 葡萄球菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶w 水解的专一性不同水解的专一性不同NHCCR1OHHCCR2ONHCCR3OH胰蛋白酶：R1=LysorArg糜蛋白酶：R1=Phe、TrporTyr嗜热菌蛋白酶：R2=Leu、Ile、Phe、Trp、Val

34、orMet胃蛋白酶：R1和/或R2=Phe、Leu、Trp、TyrNH酶裂解法酶裂解法w 化学裂解法化学裂解法w 溴化氰溴化氰(cyanogen(cyanogen bromide bromide) )只断裂由甲硫氨甲硫氨酸酸残基的羧基参加形成的肽键。w 羟胺羟胺断裂：AsnGly之间的肽链、AsnLeu及AsnAla键。w4.3.6 4.3.6 肽段氨基酸序列的测定肽段氨基酸序列的测定Amino Acids Sequence Analysisw Edmen Edmen化学降解法化学降解法Amino Acids Sequence An

35、alysis 酶降解法酶降解法 外肽酶：氨肽酶和羧肽酶外肽酶：氨肽酶和羧肽酶 The amino acid sequences of many proteins are currently deduced (推断推断) from their genes or cDNA sequences The amino acid sequence of a protein is encoded by its corresponding gene. Every three bases consist of a genetic code, which is translated into a s

36、pecific amino acid on the polypeptide chain. Sequencing DNA is much easier (faster and more accurate) than sequencing a polypeptide.Amino Acids Sequence Analysis Amino acid sequences of proteins are mostly deduced(推断推断) from their DNA sequences nowadays Proteins can be much more efficiently studied

37、with their genes availableAmino Acids Sequence Analysis根据核苷酸序列的推定法根据核苷酸序列的推定法w 根据核苷酸序列的推定法根据核苷酸序列的推定法w 用待测的蛋白质作抗原免疫动物，得用待测的蛋白质作抗原免疫动物，得相应抗体相应抗体；w 用此抗体去用此抗体去沉淀沉淀此种蛋白质的此种蛋白质的多核糖体多核糖体(polysome(polysome) )，因为在这种多核糖体上含有该蛋白质的模版因为在这种多核糖体上含有该蛋白质的模版mRNAmRNA和与和与其相连而未被释放的蛋白质多肽链；其相连而未被释放的蛋白质多肽链；

38、w 后者将与加入的抗体发生结合而使多核糖体沉淀。后者将与加入的抗体发生结合而使多核糖体沉淀。w 从沉淀中分离出该从沉淀中分离出该mRNAmRNA，并将它转录成，并将它转录成cDNAcDNA。w 测出测出cDNAcDNA的核苷酸序列的核苷酸序列，从而推测出蛋白质的氨基，从而推测出蛋白质的氨基酸序列。酸序列。w4.3.7 4.3.7 肽段在多肽链中次序的决定肽段在多肽链中次序的决定w P1794.3.8 4.3.8 二硫桥位置的确定二硫桥位置的确定Diagonal electrophoresis用胃蛋白酶水解蛋白成较小片段，将样品点在滤纸中央w4.3.9 4.3.9 蛋白质测定举例蛋白质测定举例

39、( (自学自学) )w4.3.10 4.3.10 蛋白质序列数据库蛋白质序列数据库( (自学自学) )4.4 4.4 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列 与生物功能与生物功能The amino acid sequence and the function of a protein4.4.1 4.4.1 同源蛋白质的物种差异同源蛋白质的物种差异与生物进化与生物进化w 同源蛋白质同源蛋白质w（ Homologous proteinsHomologous proteins ）w 在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质同源蛋白质。w 具有明显序列同源的蛋白

40、质也称同源蛋白质同源蛋白质。w 不变残基不变残基(invariant residue)(invariant residue)w 可变残基可变残基(variable residue)(variable residue) Most proteins of the same (or similar) functions contain crucial regions that are essential to their function and whose sequence is therefore conserved. Highly conserved residues usually play

41、 important roles in protein structure and/or function. EF-Tu protein familySubtilis枯草杆菌枯草杆菌lThe amino acid sequences of proteins provide important biochemical information (application of bioinformatic tools).A newly revealed amino acid sequence of a protein is usually compared with a large bank of stored sequences.Thousands of sequences have been revealed and stored in computerized databases (e.g., Swiss-Prot, PIR, TreEMBL). Sequence similarity usually reveals functional relatedness. PIR：蛋白质信息（鉴定）库，网址：蛋白质信息（鉴定）库，网址：/ SWISS