2010实验八不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

1、1234实验分组（每人做一管，每组配一份胶）实验分组（每人做一管，每组配一份胶）认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）封管封管分离胶配制与灌胶（浓度为分离胶配制与灌胶（浓度为6%6%，化学聚合，化学聚合，A1C2H2G5A1C2H2G5，每组总，每组总体积为体积为10ml10ml，灌胶高度为，灌胶高度为7-8cm7-8cm）封正丁醇封正丁醇3mm3mm（手法、高度、（手法、高度、15min15min左右出现折光线时可进行左右出现折光线时可进行下一步操作）下一步操作）1.1分离胶的配制分离胶的配制561.2浓缩胶的配制浓缩胶的配制781.3安装、加样、电泳安

2、装、加样、电泳910112.1电泳的概念电泳的概念122.2电泳的基本原理电泳的基本原理132.3电泳分离蛋白质的原理电泳分离蛋白质的原理142.4实验室中常用到的电泳方法实验室中常用到的电泳方法（以介质分类）（以介质分类）15163.1聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis(polyacrylamide gel electrophoresis，简称简称PAGE)PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。 1 1、

3、聚丙烯酰胺凝胶由、聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺和和甲基双丙烯酰胺甲基双丙烯酰胺聚合而形成聚合而形成的三维网状结构，聚合过程由自由基催化完成。的三维网状结构，聚合过程由自由基催化完成。 2 2、催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。、催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。 (1)(1)在化学聚合过程中，以在化学聚合过程中，以过硫酸铵（过硫酸铵（APAP）为催化剂，以为催化剂，以四甲基乙四甲基乙二胺（二胺（TEMEDTEMED）为加速剂为加速剂, TEMED, TEMED催化催化APAP产生自由基；产生自由基； (2)(2)在光聚合过程中，以在光聚合过程中，以核黄素

4、核黄素为催化剂，光催化核黄素产生自由为催化剂，光催化核黄素产生自由基。自由基引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲基双丙烯酰胺与丙烯基。自由基引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲基双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲基键交联，从而形成三维网状结构。酰胺链间产生甲基键交联，从而形成三维网状结构。173.2聚丙烯酰胺凝胶的特性聚丙烯酰胺凝胶的特性(1)(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；不溶；(3)(3)对对pHpH和温度变化较稳定；和温度变化较稳

5、定；(4)(4)几乎无吸附和电渗作用，只要几乎无吸附和电渗作用，只要AcrAcr纯度高，操作条件一致，纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；则样品分离重复性好；(5)(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达1010-6-6g g(6)(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因

6、而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。等有更高的分辨率。183.3聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类1. 1. 根据其有无浓缩效应，分为：根据其有无浓缩效应，分为：（1 1）连续系统）连续系统连续系统电泳体系中缓冲液连续系统电泳体系中缓冲液pHpH值及凝胶浓度相同，带值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应 （2 2）不连续系统）不连续系统不连续系统中由于缓冲液离子成分，不连续系统中由于缓冲液离子成分，pHpH，凝胶浓，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗

7、粒在电场中泳动不仅有电荷效应，度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。前者佳。 2. 2. 根据蛋白质样品变性与否，分为：根据蛋白质样品变性与否，分为：（1 1）变性电泳）变性电泳也就是也就是SDS-PAGESDS-PAGE，蛋白质失去二三级结构；，蛋白质失去二三级结构；（2 2）非变性电泳）非变性电泳 蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。量大小

8、、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。3.3.根据电泳槽体系的类型，分为：根据电泳槽体系的类型，分为： （1 1）圆盘电泳）圆盘电泳（2 2）板状电泳）板状电泳两者电泳原理完全相同。两者电泳原理完全相同。 19202122232425 SDS-PAGE SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由最初由shapiroshapiro于于19671967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分入

9、离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素），其原理在于：子量的大小（可以忽略电荷因素），其原理在于：1.1.去电荷：去电荷：由于由于SDSSDS（十二烷基硫酸钠）产生的十二烷基硫酸根带负电，（十二烷基硫酸钠）产生的十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质使各种蛋白质-SDS-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别；因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别； 2.2.破坏结构：破坏结构：SDSSDS能断裂分子内和

10、分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中白分子的二、三级结构。如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带；可能会形成分别对应于各个亚基的几条带；3.3.统一构象：统一构象：SDSSDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质-SDS-SDS复合复合物形成近似物形成近似“雪茄烟雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDSSDS复合物的短轴长复合物的短轴长度都一样，约为度都一样，约为18A18A；

11、 这样的蛋白质这样的蛋白质-SDS-SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原来的复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小。SDS-PAGESDS-PAGE的原理的原理26274.1 4.1 不连续不连续PAGEPAGE的原理的原理284.2不连续体系的组份不连续体系的组份 不连续体系由浓缩胶、分离胶及电极缓冲液所组成。不连续体系由浓缩胶、分离胶及电极缓冲液所组成。1. 1. 浓缩胶是由核黄素催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为浓缩胶是由核黄素催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7pH6.7的的Tris-H

12、C1Tris-HC1。2. 2. 分离胶是由分离胶是由APAP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 pH8.9 Tris-HC1Tris-HC1。3. 3. 电极缓冲液是电极缓冲液是pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。甘氨酸缓冲液。 2 2种孔径的凝胶、种孔径的凝胶、2 2种缓冲体系、种缓冲体系、3 3种种pHpH值使不连续体系形成值使不连续体系形成了凝胶孔径、了凝胶孔径、pHpH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。缩的主要因素。294.3样品浓缩效应样品浓缩效应1.1.凝

13、胶孔径不连续性；凝胶孔径不连续性；2.2.缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pHpH值的不连续性；值的不连续性；v在在pH6.7pH6.7的凝胶缓冲体系中的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：前导离子或快离子：HC1HC1解离出的氯根解离出的氯根(C1(C1- -) ) 尾随离子尾随离子(trailing ion)(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根或慢离子：甘氨酸根 m mclcl clclmmp p p p m mG G G G(Cl(Cl代表氯根，代表氯根，P P代表蛋白质，代表蛋白质，G G代表甘氨代表甘氨酸根酸根) )有效迁移率有效迁移率= =m m ，m m为迁移率，为迁移率， 为解离度为解离度) )v当进入当进入pH