新型鸭病毒性肝炎病毒

1、新型鸭病毒性肝炎病毒巢式新型鸭病毒性肝炎病毒巢式RT-PCR检测检测方法的建立及应用方法的建立及应用报告人：王梓1.鸭病毒性肝炎 鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis,DVH)是由鸭病毒性肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHV)引起雏鸭的一种以肝脏为主要病理变化的急性、高度致死性、接触性传染性疾病。鸭病毒性肝炎在临床上以发病急、传播迅速、病程短、高死亡率为主要特征，该病主要侵害4周龄以内的雏鸭,10口龄以内的雏鸭的死亡率高达90%95%。1.1 DHV的历史与分布 鸭肝炎病毒(DHV)包括三个血清型，分别引起型, 型和型鸭病毒性肝炎。其中型鸭病毒性肝炎呈世

2、界性分布。我国流行的鸭病毒性肝炎主要为型鸭病毒性肝炎，近年来陆续有新型鸭病毒性肝炎发现三个型之间无抗原相关性，没有交叉保护和交叉中和作用。DHV最早发现是在1945年由Levine在美国发现了型鸭病毒性肝炎。该病呈世界性分布，曾在加拿大、意大利、法国、日本、美国和埃及等地流行、在我国广东、北京、浙江、福建、四川、安徽、广西、江苏、山东等地相继发生该病、目前几乎世界范围内主要养鸭地区均存在该病，给养鸭业带来了巨大的经济损失。 型鸭病毒性肝炎是1958年首先爆发于英格兰诺福克鸭场，其他地区未见本病的报道。型鸭病毒性肝炎是1969年首次发现于美国纽约长岛地区。1999年，苏敬良等和黄安国等在北京和广

3、西等地在313日龄疑似鸭肝炎的北京鸭和樱桃谷鸭上分离到两株与I型和III型DHV无血清学交叉免疫反应的DHV，认为出现了新的血清型，并将其命名为新型鸭肝炎病毒。新型鸭病毒性肝炎的基因组与I型结构相似，但比I型DHV基因组稍大。同时，发现高变区主要存在于VP1和VP3基因、在VP1,VP3基因上存在多个T细胞抗原表位和B细胞抗原表位，VP1基因的变异致使不同血清型DHV抗原性发生改变。1.2 DHV的生物学特征 2006年Kim M C报道了I型DHV的全基因组序列，2007年Tseng C H报道了DHV-1型变异株全基因组序列，为DHV的研究做出了新的突破。DHV与其他小RNA病毒相比，DH

4、V基因组具有一些特殊的结构特征,TsengC H等建议将I型DHV归为小RNA病毒科一个新的独立的属。T.Yun等构建出了具有感染性的DHV全长cDNA克隆，为进一步揭示DHV基因组的结构和功能及防控该病提供了良好的技术平台。I型DHV基因组大小约为7,690nt,编码2,249aa、具有一个较大的开放阅读框(ORF)，在基因组RNA两端各有一段保守的非编码区,I型DHV全基因组结构依次为:5UTR(626nt)-VPO-VP3-VPl-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3UTR (314nt),5UTR内含有病毒翻译起始所必需的内部核糖体进入位点(IRES) I型DHV的I

5、RES己报道具有8个茎环结构，3UTR内含有病毒RNA复制和翻译有关的poly(A)尾。I型DHV的3UTR为314 nt，新型DHV的3UTR为366 nt，均具有典型的小RNA病毒的基因组结构、,I型DHV多聚蛋白具有11个切割位点，且具有与小RNA病毒相似的切割位点和保守基因序列。基因组编码区包含结构蛋白和非结构蛋白，分为3种初级前体分子P1,P2,P3,其中，P1前体蛋白裂解为组成病毒衣壳蛋白VP0,VP3和VP1，3种结构蛋白。P2和P3构成病毒的非结构蛋白。P2编码2A1,2A2,2A3,2B和2C 3种非结构蛋白，P3编码3A,3B,3C和3D 4种非结构蛋白。2.1 非编码区

6、I型DHV基因组5UTR长626 nt ,内含病毒翻译起始所必需的内部核糖体进入位点(IRES)。在各病毒属不同血清型之间，小RNA病毒IRES元件的序列和二级结构具有保守性，是病毒存活所必需的。小RNA病毒的IRES分为3个型，I型IRES的病毒包括肠道病毒属和鼻病毒属，心脏病毒属、口疮病毒属，双埃柯病毒属的IRES属于II型IRES;甲肝病毒属的IRES属于III型IRES。通过对I型DHV的RNA级结构预测表明，I型DHV的5UTR可能含有II型IRES的颈环结构而没有I型的三叶草结构， 据此推断I型DHV的5UTR区域会形成II型的IRES I型DHV的3UTR长为314-317nt，

7、新型DHV长366nt，这在小RNA病毒基因组中是最长的。有学者报道,I型DHV的3UTR形成了5个发夹结构，参与病毒的复制，但它是否与宿主特异性有关还需进一步研究。病毒的3端poly(A)尾作为病毒RNA的负链合成起始位点，其长度与负链RNA的合成效率及病毒RNA的感染能力有关。2.2 编码区 DHV包含一个大的ORF，编码一个多聚蛋白，多聚蛋白在翻译过程中不断被自身编码的蛋白酶水解，从而分解成P1、P2和P3产物，P1、P2和P3又进一步分别分解为VP0 -VP3 -VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D、I型DHV的多聚蛋白的切割位点预测的结果是:VP0/VP3和3C

8、/3D的切割位点为：Q/G;2A3/2B,2B/2C ,2C/3A,3A/ 3B以及3B/ 3C的切割位点为Q/S；VP3/VP1的切割位点为Q/M。多聚蛋白水解产生的多肤数量主要由以下因素决定: (1)基因组是否存在L蛋白。 (2)VP0是否水解为VP4和VP2。 (3)2A蛋白的数量。其也是小RNA病毒的基因组在 不同的种属之间存在的差异所在。 小RNA病毒的基因组在不同的种属间虽然存在差异，但是在病毒复制过程中具有相似的功能、,L蛋白作为前导蛋白;2A是蛋白酶，参与多聚蛋白早期切割和宿主蛋白的合成关闭;2B蛋白作为宿主范围的决定因子;2C蛋白是小RNA病毒中的保守序列，与病毒RNA合成相

9、关;3A蛋白与病毒毒力有关;3B蛋白即VPg，是共价结合于正链和负链RNA 5末端的蛋白引物;3C蛋白构成大部分多聚蛋白，3C蛋白在病毒加工处理过程和RNA复制中产生，具有水解多聚蛋白活性，并且具有一个半胱氨酸作为亲核作用的活性位点.3D蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶。 2.2.1结构蛋白结构蛋白: P1区编码病毒的壳体蛋白，包括VP0,VP3,VP1基因，核苷酸序列全长2193 nt、 I型DHV VP0的N末端缺少GxxxS/T基因序列，因此其N末端可能未被十四烷基化，VP0不被蛋白酶切割为VP2和VP4。试验证明，壳体蛋白含有多个类似于其他小RNA病毒的核心结构，即八链反向平行桶结构，与

10、其相连的环形结构位于壳粒表面，这在免疫学中占有重要作用。I型DHV的VP3与人肠道病毒(Humanparechovirus, HPeV)一样，N一末端有一段残基丰富区延伸出来，长度约20aa,这段区域在HPeV中具有很强的免疫原性但它在I型DHV是否也具有同样的功能还未见报道。(1)VPl基因基因: 小RNA病毒中VP1蛋白作为主要的宿主保护蛋白，具有特异性抗原中和位点，VP1蛋白多暴露于病毒表面，是决定病毒抗原性的主要成分，它能够诱导动物产生中和抗体。I型DHV与其他小RNA病毒之间衣壳蛋白的氨基酸序列差异主要存在于VP1的两端。何内娅通过对华南地区分离到的I型和新型DHV的VP1氨基酸序列

11、比对分析表明:VP1包括了大部分的插入与缺失片段和高变异区，高变区主要分布在46 -64,95-149,180-223位，尤其是C末端，存在点突变或连续变异。在第145-146位，15株新型DHV毒株比3株I型DHV多2个氨基酸(G和G)。I型DHV和新型DHV的VP1蛋白不存在小RNA病毒科保守的RG D基序(Arg-Gly-Asp(RGD) ,而I型DHV相应序列为SGD，而新型DHV为QSD，这表明DHV的病毒吸机制和复制能力存在差异还有待于进一研究。(2)VP3基因基因: VP3蛋白的N末端具有免疫原性，VP3的N端以及连接链的环，特别是B-C,E-F及G-H环的序列差异显著、何内娅通

12、过对华南地区分离到的I型和新型DHV与参考毒株进行VP3基因的变异分析，结果显示，I型DHV和新型DHV的VP3基因不同点在于:第三位I型(R) 新型(K)，第15位I型(N) 新型(S)(除了台湾新型)，第20位I型(P)新型(S)，第22位I型(V) 新型(I)，第39,40位I型(IA) 新型(VT)，第45、69位I型(T,I) 新型(A/V , V)，第78位第107位为I型和新型DHV变异最多处，第125,126位I型(MT) 新型(LL)，第143到第234位I型和新型DHV存在不连续的多位点不同，这些变异区是否影响I型和新型DHV的致病机理有待于进一步研究。 2.2.2非结构蛋

13、白非结构蛋白: (1)P2非结构蛋白: 小RNA病毒中，P2区长2271nt,I型DHV推测具有多达3种不同的2A蛋白，分别是2A1 ,2A2和2A3以及2B,2C。DHV的2A2蛋白是小RNA病毒多聚蛋白中的1个新蛋白，由161aa组成，可能参与病毒与宿主细胞之间相互作用，推测与病毒复制有关。2A3蛋白由124aa组成，含有3个结构域。2A3蛋白可能在控制细胞生长方面起作用，目前关于小RNA病毒2B和2C蛋白的具体功能还不清楚。(2)P3非结构蛋白非结构蛋白: P3区编码4种非结构蛋白，分别是3A ,3B ,3C和3D。据报道，小RNA病毒科的病毒,3A蛋白与病毒毒力有关。3BVPg蛋白包含

14、34个as，这在小RNA病毒中是最大的3B蛋白，并且与其他小RNA病毒的3B蛋白序列一致性很低，DHV的L(亮氨酸)被小RNA病毒KP基序中的K(赖氨酸)所取代，但是该蛋白第3位酪氨酸Tyr (Y)残基却很保守，它在VPg与基因组5末端尿嘧啶的附着过程中起重要作用。DHV的3C蛋白酶是催化裂解小RNA病毒多聚蛋白中非结构蛋白部分的关键酶，具有丝氨酸蛋白酶和半肤氨酸蛋白酶双重特性，病毒编码的3C蛋白酶完成多聚蛋白的大多数切割，通常发生在谷氨酞胺和甘氨酸之间的肤键( Gln-Gly ) ,最终产生11个终末产物。DHV的3D蛋白是依赖RNA的RNA聚合酶( RNA-dependent RNA po

15、lymerase),3D蛋白在病毒RNA复制中起主导转录及复制作用。2.新型鸭病毒性肝炎病毒巢式新型鸭病毒性肝炎病毒巢式RT-PCR检检测方法的建立及应用测方法的建立及应用 近年来，DVH在世界各地不断发生，其发病率和死亡率均呈上升趋势，养鸭比较集中的地区均遭受了巨大的经济损失和严重的威胁，由于新型鸭病毒性肝炎病毒(N-DHV)的存在，许多地区频频出现I型鸭病毒性肝炎病毒(DHV- I)免疫鸭群暴发鸭肝炎的报道，严重制约了养鸭业的发展，不少学者己从发病鸭群中分离到工型鸭肝炎病毒的变异株(新型毒株,N-DHV),2007年，有学者先后证实新型DHV也具有典型的DHV I基因组结构，但其与DHV

16、-I在序列上存在显著差异，且新型DHV均不与DHV- I产生交叉反应。因此，加强N-DHV病原诊断技术的研究对预防和控制鸭病毒性肝炎具有重要的现实意义。本试验选取新型DHV与传统工型DHV差异序列区设计引物，建立了N-DHV检测的逆转录巢式PCR方法，旨在为新型鸭病毒性肝炎的早期诊断、流行病学调查等提供一种有效的分子生物学检测方法。2.1 材料和方法材料和方法 2. 1.1 病毒病毒 N-DHV、DHV-、鸭病毒性肠炎病毒(DEV)、鸭细小病毒(DPV)、新城疫病毒(NDV )、传染性法氏囊病毒(IBDV)均由本实验室分离并保存。 2.1.2主要试剂主要试剂 Trizol、M-MLV反转录酶、

17、Ribonuclease Inhibitor购自生工生物工程(上海)有限公司;Ex Taq酶、pMD18-T克隆载体及其他限制性内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司;质粒DNA提取试剂盒与胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。 2.1.32.1.3引物的设计与合成引物的设计与合成 根据己发表的N-DHV基因组序列，选取N-DHV与DHV- I差异序列区设计引物，利用生物学软件设计合成了2对引物，引物序列如下: 第1轮扩增引物: 上游引物:ygpl 5-TUTUCCTUAUAAUCUUUATA-3; 下游引物:ygp2 5-CCUAAAUTUUAUATTAUUTG3; 第2轮扩增引物:

18、上游引物:ygp3 5-CAUCCACAUCCAUCUACAACr3; 下游引物:ygp4 5-TTUCTCTUCUUTATCCTUCC-3。 2.1.42.1.4病毒基因组病毒基因组RNARNA的提取的提取 按Trizol试剂使用说明提取N-DHV基因组RNA，并提取其他几种病毒的DNA或RNA。 2.1.5 RT-PCR2.1.5 RT-PCR反应反应 2.1.5.1反转录合成cDNA 反转录反应按20L,体系操作，反转录条件为42作用60 min后，95 5 min灭活反应。 2.1.5.2 PCR反应最适模板用量的确立 分别以2,4,6,8,10,12L反转录cDNA为模板，保持其他试

19、剂浓度及反应条件不变，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳模板用量。 2.1.5.3 PCR反应最适引物用量的确立 在50L PCR反应体系中分别加入不同用量的引物，上下游引物(20 mol/L)分别入0.1,0.3,0.5, 0.7, 1,1.2L对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳引物用量。 2.1.5.4 PCR反应最适退火温度的确立 PCR反应的退火温度分别取 50, 52, 54, 56, 58，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳退火温度。 2.1.5.5第1轮PLR扩增反应 PCR反应按50L体系进行，根据本试验确定的最适模板用量为10L，最适引物用量为0. 5

20、L，最适退火温度为54，确定PCR反应体系为:0. 5L Ex Taq(5 U/L)、5 L 10 X Ex Taq Buffer 5L dNTP(2. 5mmol/L）、上下游引物ygp1、ygp2（20mo1/L)各0. 5、10L cDNA，加水至50L。PCR反应条件为:944 min;94 45s、54 45s、，72 60s、30个循环;72 10 min。 2.1.5.6第2轮PCR扩增反应 PCR反应按50L ，体系进行，模板为第1轮PCR产物1L，最适引物用量为0. 5L，最适退火温度为5 4，确定PCR反应体系为:0. 5 LEx Taq(5 U/pL)、5 L 10XEx

21、 Taq Buffer 5LdNTP (2. 5 mmol/L)、上下游引物ygp3、ygp4 (20 mol/L)各0. 5L，加水至50L。PCR反应条件同2.1.5.5 2.62.6扩增产物的检测及鉴定扩增产物的检测及鉴定 首先取扩增产物5L在10 g/L二的琼脂糖凝胶上电泳，利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定。然后用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段与pMD18-T克隆载体于4过夜连接，转化感受态菌株DH5。挑取单个的转化菌落，加LB溶液培养12 h后用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA，利用EcoR/Hind双酶切鉴定，阳性的克隆送生工公司进行测序鉴定。将测序结果与N-D H V毒

22、株序列进行同源性比较。 2.7 PCR2.7 PCR特异性试验特异性试验 分别提取N-DHV、DHV- ,NDV,IBDV、健康鸭肝组织的RNA, DEV、DPV的DNA，用己建立的方法进行扩增。 2.8 PCR2.8 PCR敏感性试验敏感性试验 N-DHV标准毒株提取RNA后定量，然后10倍梯度稀释提取的病毒基因组RNA，使其分别相当于含有10、1、0.1 L、10、1、0. 1、0.01pg RNA的含量，分别进行RT-PCR检测，确定其敏感性。在第2轮PCR中，利用上而不同的病毒RNA浓度进行的RT-PL R产物1 L为模板，进行巢式PCR检测，反应程序不变，确定巢式PCR的敏感性。 2

23、.9 PCR2.9 PCR重复性试验重复性试验 用建立的巢式RT-PCR检测方法，对N-DHV 、DHV- I 、NDV、IBDV、DEV、 DPV、健康鸭肝组织及检测为新型鸭病毒性肝炎阳性病料3份和阴性病料3份，重复检测3次，以验证本方法的重复性和稳定性。 2. 10初步应用临床样品检测 取疑似送检病料21份，利用建立的RT-PCR检测方法进行检测，对扩增产物全部进行测序鉴定，并利用生物学软件进行序列分析。3. 实验结果 3.1扩增产物的检测及鉴定 3.1.1扩增产物的检测 PCR扩增产物经过10g/L二琼脂糖凝胶电泳，第1,2轮扩增产物在位于706、502 bp处可见特异性DNA扩增条带，

24、与预期大小相符。 M：DL2000 DNA Markcr1 、4： 是2对引物的空白对照2：第1轮扩增的PCR产物3：第2轮扩增的PCR产物 3.1.2克隆载体的酶切鉴定 扩增产物连接到pMD18-T克隆载体上，根据病毒基因组的序列结构，利用EcoR和Hind进行双酶切鉴定。M：DL200CDNA Markcr1 , 2：第1,2轮扩增产物重组质粒的 EcoR和Hind的双酶切产物 3. 1. 3扩增产物的测序鉴定 挑取双酶切鉴定正确的阳性菌液送生工公司测序。DNA测序结果表明，插入到T载体的基因片段的核普酸序列为N-DHV。 3.2特异性试验结果 利用设计的第1轮引物对N-DHV扩增出了70

25、6 bp的目的基因片段，而DHV-、NDV , IBDV、健康鸭肝组织、DEV,DPV均未扩增出目的片段(图3)。取PCR产物各1 L为模板，利用第2轮引物进行巢式PCR检测，结果N-D H V出现502bp的扩增产物，而D H V-、NDV、IBDV、健康鸭肝组织、DEVDPV均未扩增出目的片段(图4)。第1轮扩增的特异性试验M：DL2000 DNAMarKer1: N-DHV2: DHV-3: NDV4: IBDV5: 健康鸭的肝组织6. DEV7. DPV（图3）第2轮扩增的特异性试验M.:DL2000 DNAMarker1:N-DHV;2:DHV-;3: NDV4: IBDV5.健康鸭

26、肝组织6. DEV7. DPV（图4） 3.3敏感性试验结果 2种引物敏感性试验的PCR产物取5L经10 g/L二琼脂糖凝胶电泳分析，分别在约706 ,502 bp附近出现特异性条带，与各自的预期产物大小相符。从结果可以看出第1轮引物的RT-PCR检测灵敏度可以达到10 pg RNA，而第2轮引物的RT-PCR检测灵敏度可以达到0. 1 p RNA。第1轮扩增的敏感性试验M：DL2000 DNAMarKer17： 10、1,0.1L、10、1、0. 1、0. 01pg RNA第2轮扩增的敏感性试验M：DL2000 DNAMarKer17： 10、1,0.1L、10、1、0. 1、0. 01pg

27、 RNA 3.4重复性试验结果 经过3次重复操作，结果一致，说明建立的方法是稳定可靠的。 3.5临床样品检测结果 用建立的N-DHV巢式RT-PCR检测方法，共检测了21份在不同地采集的鸭病料。检出阳性样品3份，对阳性样品PCR产物全部进行克隆与序列分析，结果均为N-DHV。4. 讨论讨论 由于N-DHV在自然条件下感染成年鸭后，感染者可长期带毒和排毒而不出现临床症状，在这些情况下，病鸭组织中病毒含量较低，而且组织样品中因含有大量的蛋白和脂类等可能会影响PCR扩增，将反转录产物直接用于PCR扩增很难见到扩增片段。巢氏PCR(nested PCR)是PCR的一种改良模式，是指利用2对PLR引物进

28、行2轮PCR扩增反应。首先对靶DNA进行第1步扩增，然后从第1次反应产物中取出少量作为反应模板进行第2次扩增，第2次PCR引物与第1次反应产物的序列互补，第2次PCR扩增的产物即为目的产物。 由于巢式PCR反应有2次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了检测的敏感性;又有2对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。巢式RT-PCR技术通过反转录产物的PCR和巢式PCR的2次扩增，首次反应产物的转移有助于稀释掉那些最初可能存在于样品中的抑制物，大大提高了检测的灵敏度，避免了样品检测过程中的假阴性问题。巢式RT-PCR技术具有敏感性高、特异性强、快速高效等特点，为鸭病毒型肝炎

29、的早期诊断提供了新的模式。 本试验参考UenBank中己发表DHV-I和几株N-DHV的基因组序列，经过多重序列 比对分析。选取DHV- I与N-DHV序列变化差异明显区设计合成2对新型鸭病毒性肝炎的特异性引物，建立了N-DHV检测的巢式RT-PCR检测方法， 该方法只对N-DHV能够特异性地扩增出706 bp和502 bp的目的片段，而对NDV、IBDV、DEV、DPV的扩增结果均为阴性，具有良好的特异性，该方法第1次扩增的敏感性为10 pg，第2次扩增的敏感性达到0. 1Pg，敏感性提高了100倍，具有良好的敏感性。在21份临床样品的检测过程中，利用第1轮RT-PCR检测出阳性样品2份，而

30、利用巢式RT-PLR检测时可以检出阳性样品3份，将所有阳性样品的PCR产物进行测序后，序列分析结果显示均是N-D H V，说明建立的巢式RT-PLR检测方法更为敏感、特异，可以用于原始病料中N-DHV的快速低含量检测，显示出了良好的应用前景。因此，本研究建立的巢式RT-PCR方法将为国内新型鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查等提供一种简单快速的分子生物学诊断方法。鸭鸭 病病 毒毒 性性 肝肝 炎炎 与与 鸭鸭 瘟瘟 鸭病毒性肝炎是引起雏鸭传播迅速和高度致死的传染病，病原为鸭肝炎病毒。鸭病毒性肝炎有 3 种血清型，在我国流行的主要为 I 型。一般多发于15周龄的雏鸭, 对成年鸭没有影响。对氯仿、乙

31、醚、胰蛋白酶和pH值3的环境均有抵抗力。在 56加热60分钟仍可存活，但加热至62，30分钟即被灭活。病毒在1%福尔马林或 2%氢氧化钠中2小时、在 2%漂白粉溶液中3小时、 0.2%福尔马林37，30分钟均可使病毒灭活。 鸭瘟是由鸭瘟病毒引起的急性、高度死亡率的传染病，又称为鸭病毒性肠炎，俗称 “大头瘟”鸭瘟病毒是疱疹病毒， 病毒粒子呈球形。病毒对外界抵抗力不强。病毒对乙醚和氯仿敏感。病毒在pH值7 9时，经6小时不减低毒力，在pH值3和11时，病毒迅速灭活。各种年龄和品种的鸭均可感染，但鸭瘟流行时，成年鸭发病和死亡较严重，1月龄以下的雏鸭发病较少。本病于全年各季均可发生， 但以春夏之交和秋季最易流行。本病主要通过消化道传播，也可通过交配、眼结膜和呼吸道而传播。 鸭病毒性肝炎临床上主要表现为雏鸭突然发病，身体侧翻仰卧，头向后背双脚痉挛后蹬，角弓反张。主要病变在肝脏，肝脏肿大，质脆，色暗或发黄，肝脏表面有大小不等