重组腺相关病毒rAAV在神经科学中的应用

1、重组腺相关病毒rAAV中科院神经所病毒平台2017年1月腺相关病毒（rAAV）简介 腺相关病毒、细小病毒科 无包膜单链DNA病毒，基因组长约4.7-6 kb 是迄今发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，通常需要在辅助病毒的辅助下才能发生产毒性感染，生成子代AAVAAV的基因组及其编码的蛋白 AAV病毒颗粒示意图；B：AAV病毒基因组结构（Kotterman MA et al. Nat Rev Genet. 2014.）病毒载体选择指南 AdenovirusAdeno-associated Virus (AAV)Lentivirus基因组dsDNAssDNAssRNA (+)包膜无无有基因

2、组大小38-39 kb5 kb9 kb细胞感染分裂细胞和非分裂细胞分裂细胞和非分裂细胞分裂细胞和非分裂细胞整合机制非整合定向整合整合持续时间3个月2个月包装能力7.5 kb4.5 kb6 kb免疫原性强弱一般滴度1011-12 vg/mL1012-13 vg/mL108-9 vg/mL转导效率100%70%70%AAV载体的优势与局限 优势 安全性高 无致病性、不整合、低免疫原性 表达时程长 5个月高效稳定表达 嗜性广 分裂及非分裂细胞（神经元）、多种血清型实现不同靶向 局限 外源基因容载能力有限 4.7 Kb 通用启动子高表达外源基因的毒性rAAV三质粒制备系统 A：rAAV载体原理（Kot

3、terman MA et al. Nat Rev Genet. 2014.）；B：制备rAAV的三质粒系统示意图（Ayuso E et al. Curr Gene Ther. 2010.）传统三质粒制备AAV系统的缺陷 生产能力低 103-104vg/cel 难满足灵长类研究及临床需求 病毒质量不稳定 多批次包装条件不均一 纯化过程导致的空壳率不可控 新型rAAV杆状病毒制备系统杆状病毒系统制备rAAV的流程图新型AAV杆状病毒制备体系的优势灵活性高、通用性强、病毒质量高、产量高，适于大规模放大生产，rAAV纯化后能够达到很高的纯度，可有效解决非人灵长类动物神经环路标记的大量需求。 纯化后的r

4、AAV病毒经过扫描电镜检测扫描电镜检测，完整完整的的rAAV颗粒比例大于颗粒比例大于85%， 病毒质量高病毒质量高。纯化后的rAAV处理后进行SDS-PAGE凝胶电泳考马斯亮蓝染色检测凝胶电泳考马斯亮蓝染色检测，可以观察到明显的病毒粒子衣壳蛋白VP1，VP2，VP3所对应的1:1:10 比例组成的三种蛋白，分子量与预期一致，纯度高于纯度高于95%。AAV的血清型与其对细胞组织的转导特性 不同血清型AAV对小鼠组织细胞的嗜性差异很大（Karen Kozarsky et al. Nat Methods. 2010.）rAAV的应用-视网膜内界膜细胞的感染在内界膜注射 rAAV2-CBA-GFP，病

5、毒感染效果图。A：在注射部位，大部分的视网膜神经细胞病毒表达水平都很高 ；B: 视网膜muller细胞和双极细胞均检测到信号（Boye SE et al. Hum Gene Ther. 2016）rAAV在肝脏纤维化研究中的应用rAAVX-EYFP感染肌成纤维细胞效果图（Rezvani M et al. Cell Stem Cell. 2016.）rAAV的应用-脑中枢神经元的感染rAAV-GFP注射海马感染效果图（Broekman ML et al. Neuroscience. 2006.）rAAV的应用-神经元投射研究rAAV注射红核区，分别在7 d和30 d观察转导效率和感染RN细胞的特

6、异性（Blits B et al. J Neurosci Methods. 2010.）rAAV的应用-心脏心肌细胞的感染 不同血清型不同滴度的rAAV病毒感染心肌细胞（Prasad KM et al. Gene Therapy. 2011.）rAAV的应用-骨骼肌细胞感染AAV-lacZ注射肌细胞，原位杂交检测病毒的表达量（Kessler PD et al. PNAS. 1996.）rAAV的应用-肺部细胞的感染在CMV和RSV启动子调控下AP在肺部的表达情况（Halbert CL et al. Hum Gene Ther. 2007.）rAAV的应用-神经示踪图a.利用狂犬病毒系统逆向追踪小鼠背外侧被盖区（LDT）中PV阳性和SOM阳性中间神经元的直接调控网络示意图；图b. LDT中PV阳性和SOM阳性中间神经元都接受来自外侧僵核（LHb）的直接调控(Yang H et al. Nat Neurosci. 2016.）rAAV