第11章,色谱分析法,修改

1、碳酸钙碳酸钙石油醚石油醚植物植物色素色素色谱分析色谱分析基于物质的物理性质进基于物质的物理性质进行分离和分析的方法。行分离和分析的方法。色谱法是一种色谱法是一种分离分离方法，其特点为存在两相方法，其特点为存在两相将色谱法用于分析中，称为色谱分析将色谱法用于分析中，称为色谱分析碳酸钙碳酸钙石油醚石油醚碳酸钙碳酸钙石油醚石油醚气固色谱气固色谱(GSC)气液色谱气液色谱(GLC)按固定相状态分为按固定相状态分为流动相流动相进样进样装置装置色谱柱色谱柱检测器检测器数据记录数据记录与处理与处理min05101520253035mAU020406080100 DAD1 C, Sig=270,16 Ref=

2、360,100 (HUPINGDSLS-A21.D)样品样品色谱峰色谱峰峰高峰高基线基线峰宽峰宽半峰宽半峰宽峰面积峰面积标准偏差标准偏差EEt正态分布正态分布 定性、定量定性、定量 分离效果显分离效果显示示进进样样空空气气峰峰tRtRtM进进样样空空气气峰峰tRtRtM2211RR21RRtVr=tV2ln22 窄窄分离效果分离效果一般一般 窄窄 峰间距大峰间距大（ t大）大）峰窄峰窄（操作条件操作条件） 色谱分离的效果：色谱分离的效果： 两组分峰间距足够远两组分峰间距足够远每个组分峰宽足够小每个组分峰宽足够小窄窄上式既反映峰间距也反映峰宽的情况，利用上式既反映峰间距也反映峰宽的情况，利用此式

3、，可直接从色谱流出曲线上求出此式，可直接从色谱流出曲线上求出R。 定义：定义：相邻两组分色谱峰保留值之差与两个相邻两组分色谱峰保留值之差与两个组分色谱峰峰底宽度总和之半的比值。组分色谱峰峰底宽度总和之半的比值。(2)(1)(1)(2)2(-)()RRttWWR =R=1.5 通常用作是否分开的通常用作是否分开的判据判据 要改善物质对的分离（提高要改善物质对的分离（提高R），即），即提高两相邻物质的分离度，增大提高两相邻物质的分离度，增大r21 是是最有最有效效的手段。的手段。 在气相色谱中，在气相色谱中，增大增大r21最有效的手段是最有效的手段是改变固定相，改变固定相，选择合适的固定相种类是解

4、决选择合适的固定相种类是解决分离问题的关键。分离问题的关键。 在高效液相色谱中，流动相的种类和配在高效液相色谱中，流动相的种类和配比是改善分离最简便有效的方法。比是改善分离最简便有效的方法。改变柱温也可改变改变柱温也可改变r21。 各物质在一定的色谱条件下均有确定各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，故可作为定性指标。不变的保留值，故可作为定性指标。 利用纯物质对照定性利用纯物质对照定性 利用文献值对照定性（很少用）利用文献值对照定性（很少用） 混合物经色谱分离后，将各组分直接混合物经色谱分离后，将各组分直接由由接口接口导入其它仪器中进行定性。常用的导入其它仪器中进行定性。常用的联用方

5、法有：联用方法有：GC-MS、GC-FTIR、LC-MS 使用范围：复杂样品的定性。使用范围：复杂样品的定性。 优点：不需要标准物，定性结果可信度优点：不需要标准物，定性结果可信度 高，操作方便。高，操作方便。 缺点：需要特殊仪器或设备。缺点：需要特殊仪器或设备。测量与计算测量与计算mi=fi .Ai 在一定色谱条件下，在一定色谱条件下，被测被测物质的量与峰面积成正比物质的量与峰面积成正比。iSSiSSiiSiiAmAmA/mA/mfff iii=Amf%100%100%100%()iiiiiiii总mmcmmA fA fsssiiissiisimfAfAm fAfAmm 常常数数总总总总 s

6、isssiiiiAA%100mfAmfA%100mm%C内标法内标法%CAA%Cssii 气路气路色谱柱色谱柱进样进样检测器检测器数据记录数据记录与处理与处理 5.记录系统记录系统:将电信号放大将电信号放大,记录出色谱图记录出色谱图,经数据处理经数据处理得出结果，现用色谱工作站得出结果，现用色谱工作站气路气路色谱柱色谱柱进样进样检测器检测器数据记录数据记录与处理与处理 气相色谱分离过程是在色气相色谱分离过程是在色谱柱内完成的。谱柱内完成的。固定相固定相固体吸附剂固体吸附剂担体和固定液担体和固定液吸附与脱附吸附与脱附溶解与挥发溶解与挥发组组分分在在流流动动相相中中的的浓浓度度组组分分在在固固定定

7、相相中中的的浓浓度度 )mL.g(c)mL.g(cK1l1sK小小 Cl 随载气移动快，随载气移动快，tR 小，小，先出峰先出峰不同组分能够分离的先决条件是其分配系数不不同组分能够分离的先决条件是其分配系数不等。两组分分配系数相差等。两组分分配系数相差越大越大，两峰分离的就，两峰分离的就越好越好。固定液类型固定液类型极性极性应用特点应用特点固定液举例固定液举例烃类烃类最弱最弱非极性化合物非极性化合物角鲨烷角鲨烷硅油类硅油类极性范围广极性范围广应用范围广应用范围广SE-30、SE-54聚乙二醇类聚乙二醇类强极性强极性强极性化合物强极性化合物PEG-20M酯类酯类中强极性中强极性价廉价廉苯二甲酸二

8、壬苯二甲酸二壬酯酯腈类腈类强极性强极性极性化合物极性化合物一氧二丙腈一氧二丙腈特殊固定液特殊固定液分离异构体分离异构体有机皂土有机皂土(2) 固定液分类及其应用固定液分类及其应用以非极性角鲨烷的以非极性角鲨烷的P=0 强极性强极性一氧二丙腈一氧二丙腈P=100为基准，分五级。为基准，分五级。各组分在其的溶解能力。各组分在其的溶解能力。参比池测量池(A)双臂热导池(B)四臂热导池热导池结构示意图热丝热丝(3) 检测原理 基于不同的物质具有不同的热导系数(4) 操作条件的选择(3) 原理 蒸气分子受激发后被离子化，在电场作用下定向运动形成离子流，然后进行放大和记录。 (4) 操作条件的选择气体流量

9、 载气:氢气:空气=1:1:10气体纯度：要求高使用温度：大于80柱温选择的原则：柱温选择的原则： 在使最难分离的组分能尽可能好的分离在使最难分离的组分能尽可能好的分离前提下，尽可能采取前提下，尽可能采取较低的柱温较低的柱温，以保留时，以保留时间适宜，峰形间适宜，峰形不拖尾不拖尾为度。柱温为度。柱温不能高于固不能高于固定液的沸点定液的沸点，否则挥发流失。，否则挥发流失。tc=45tc=12030801201801.丙烷丙烷2.丁烷丁烷3.戊烷戊烷4.己烷己烷5.庚烷庚烷6.辛烷辛烷7.溴仿溴仿8.间氯甲苯间氯甲苯9.间溴甲苯间溴甲苯填充柱填充柱13m，要求要求动作快动作快、时间短时间短。（1）

10、分离效率高：比填充柱高）分离效率高：比填充柱高10100倍；倍；（2）分析速度快：比填充柱色谱分析速度快；）分析速度快：比填充柱色谱分析速度快；（3）色谱峰窄、峰形对称。较多采用程序升温；）色谱峰窄、峰形对称。较多采用程序升温；（4）灵敏度高，一般采用死体积小，灵敏度高的）灵敏度高，一般采用死体积小，灵敏度高的检测器，如检测器，如FID；1.1.特点特点(1) 无填料、阻力小，长可达百米，管径无填料、阻力小，长可达百米，管径0.2 mm 。(2) 柱容量小，允许进样量小。柱容量小，允许进样量小。(3) 总柱效高，分离复杂混合物的能力大为提高。总柱效高，分离复杂混合物的能力大为提高。(4) 操作

11、条件严格，要求柱外死体积小。操作条件严格，要求柱外死体积小。(5) 在仪器结构上增加了尾吹和分流。在仪器结构上增加了尾吹和分流。一、概述 GCHPLC应用范围应用范围能气化、热稳定、能气化、热稳定、低沸点的物质低沸点的物质热不稳定、高沸点、热不稳定、高沸点、离子型的物质离子型的物质热力学理论热力学理论较成熟较成熟正在发展中正在发展中分析成本分析成本低低高高分离能力分离能力与柱的类型有关与柱的类型有关较高较高4、高效液相色谱法、高效液相色谱法2. 高效液相色谱法的特点高压：用高压泵使流动液能迅速通过色谱柱高效：与单位长度气相柱效能比高十多倍高灵敏度：最小检测量可达10-9 g，甚至10-11 g

12、高速：配备高压输液设备，流速达1ml/min。应用范围广泛：可分析80%有机化合物4、高效液相色谱法、高效液相色谱法可用于高沸点的、不能气化的、热不稳定的以可用于高沸点的、不能气化的、热不稳定的以及具有生理活性物质的分析及具有生理活性物质的分析 二. 高效液相色谱仪高压输液系统高压输液系统进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统4、高效液相色谱法、高效液相色谱法恒流泵：恒流泵：输出流量保持恒定输出流量保持恒定恒压泵：恒压泵：输出压力恒定输出压力恒定目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两机械泵，它又分机械注射泵和

13、机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。种，应用最多的是机械往复泵。 高压输液泵要求：密封性好，输出流量高压输液泵要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，耐腐蚀等。恒定，压力平稳，可调范围宽，耐腐蚀等。4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置，通常使用耐高压的六通阀进样装置，4、高效液相色谱法、高效液相色谱法进样阀进样阀色谱柱是液相色谱的色谱柱是液相色谱的心脏部件心脏部件色谱柱色谱柱柱管：柱管：固定相：固定相：不锈钢、铝、铜等不锈钢、铝、铜等柱长柱长530cm，内径为，内径为45mm柱体为直型不锈钢管柱体为

14、直型不锈钢管4、高效液相色谱法、高效液相色谱法检检测测器器仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，如紫外、荧光、电化学检测器等如紫外、荧光、电化学检测器等对试样和洗脱液总的物理或化学性质有对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应。如示差折光，电导检测器等。响应。如示差折光，电导检测器等。4、高效液相色谱法、高效液相色谱法4、高效液相色谱法、高效液相色谱法1. 紫外检测器4、高效液相色谱法、高效液相色谱法(1) 原理：原理：朗伯比尔定律。朗伯比尔定律。固定波长的紫外检测器固定波长的紫外检测器可变波长的紫外检测器可变波长的紫外检测器二极管阵列检测器二极管阵列检测器

15、(3) 紫外检测器分类紫外检测器分类4、高效液相色谱法、高效液相色谱法(A) 固定波长的紫外检测器4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 (B) 可变波长的紫外检测器4、高效液相色谱法、高效液相色谱法(C) 光电二极管阵列检测器一系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上约一系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上约1nm谱带宽的单色光，各检测特定波长，计算机快谱带宽的单色光，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。速处理，三维立体谱图。4、高效液相色谱法、高效液相色谱法2. 差示折光检测器4、高效液相色谱法、高效液相色谱法(1) 原理：原理：通过连续检测参比池和样品池中通过连续检测参比池和样

16、品池中流动相之间的折射率之差值来测定样品浓度流动相之间的折射率之差值来测定样品浓度（折射率差值与浓度呈正比）。（折射率差值与浓度呈正比）。(2) 特点：特点：通用型检测器（物质具有折射率）通用型检测器（物质具有折射率） 灵敏度低、对温度敏感、灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱不能用于梯度洗脱。(3) 结构：结构：偏转式、反射式和干涉型三种偏转式、反射式和干涉型三种4、高效液相色谱法、高效液相色谱法4、高效液相色谱法、高效液相色谱法(1) 原理：原理：根据物质在某些介质中电离后根据物质在某些介质中电离后产生电导变化来测定电离物质的含量。产生电导变化来测定电离物质的含量。(2) 特点：特点：广

17、泛用于离子色谱仪中。应广泛用于离子色谱仪中。应用于能电离成离子物质的检测。响应受用于能电离成离子物质的检测。响应受温度影响较大。温度影响较大。(3) 结构：结构：由一对平行的铂电极（表面镀由一对平行的铂电极（表面镀铂黑以增加表面积）和池体构成电导检测铂黑以增加表面积）和池体构成电导检测池，两电极构成电桥的一个测量臂。池，两电极构成电桥的一个测量臂。3. 电导检测器4、高效液相色谱法、高效液相色谱法三. HPLC主要分离类型及其原理 化学键合相色谱法 液固色谱法 离子交换色谱法 体积排阻色谱法 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法4、高效液相色谱法、高效液相色谱法4、高效液相色谱法、高效液相色谱法

18、根据化学键合相与流动相极性的相对强弱根据化学键合相与流动相极性的相对强弱C8柱，柱，C18柱柱4、高效液相色谱法、高效液相色谱法(3) 固定相 固定相应符合下列要求：颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压；化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。4、高效液相色谱法、高效液相色谱法4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 键合固定相类型键合固定相类型 非极性键合相非极性键合相 ： 非极性烃如非极性烃如C18,C8与苯基等键合在硅胶表面与苯基等键合在硅胶表面 用于用于反相反相色谱；色谱；弱极性键合相：弱极性键合相： 醚基和二羟基等键合相醚基和二羟基等键合相 用于用于反相或正相反相或正相色谱色谱 极性键

19、合相：极性键合相： 常用氨基常用氨基氰基键合相键合硅胶氰基键合相键合硅胶 一般用于一般用于正相正相色谱色谱 (4) 流动相4、高效液相色谱法、高效液相色谱法4、高效液相色谱法、高效液相色谱法溶剂的种类 正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿等，己烷为主体，加入质子接受体乙醚或甲基叔丁基醚，质子给予体氯仿，偶极溶剂二氯甲烷 反相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙醇及其混合物等，以水为主体，加入质子接受体甲醇，质子给予体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。4、高效液相色谱法、高效液相色谱法正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱固定相固定相极性极性非极性非极性流动相流动相非极性非极性极性极性溶质分子与固定相溶质分子与

20、固定相作用力作用力极性作用力（偶极、极性作用力（偶极、氢键）氢键）“强烈强烈”色散力（非选择性）色散力（非选择性）“微弱微弱”溶质分子与流动相溶质分子与流动相作用力作用力色散力（非选择性）色散力（非选择性）极性作用力（偶极、极性作用力（偶极、氢键）氢键）极性溶质极性溶质保留时间随极性增保留时间随极性增大而增大大而增大小或难保留小或难保留非极性溶质非极性溶质小或难保留小或难保留可保留，保留时间可保留，保留时间随极性减少而增大随极性减少而增大4、高效液相色谱法、高效液相色谱法2. 液固色谱法 (1) 分离原理 以固体吸附剂为固定相、液体为流动相的液相色谱法。4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法l硅胶为固定相时：以弱极性的正构烷烃为主体，加入二氯甲烷等中等极性溶剂调节合适的洗脱强度。l可用水对硅胶进行减活处理，或加入四氢呋喃、乙腈、甲醇、异丙醇等改性剂4、高效液相色谱法、高效液相色谱法(4) 应用中等分子量的油溶性样品如油品、脂肪、芳烃等不同极性取代基的化合物结构异构体和几何异构体混合物的分离4、高效液相色谱法、高效液相色谱法3. 离子交换色谱法和离子色谱法 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法（2）固定相 离子交换树脂，根据功能基分为 强酸型（磺酸基团） 强碱型（季铵基） 弱酸型（羧酸） 弱碱型（伯、仲、叔胺）4、高效