ELISA的基本原理和质量控制ppt课件

1、1.加样加样2.孵育孵育3.洗涤洗涤4.参与二抗参与二抗5.孵育孵育6.显色显色间接法间接法ELISA运用运用RFRF吸附剂吸附剂 类风湿因子10是一种本身抗体，主要有IgM组成，能与抗原抗体复合物的FC段结合，非特异性IgM抗体风湿因子的存在将导致IgM检测出现假阳性结果。麻疹IgG麻疹抗原麻疹IgM抗人酶标抗人酶标IgM抗体抗体类风湿因子阳阳性性结结果果假假阳阳性性结结果果RFRF吸附剂的组成吸附剂的组成RFRF吸附剂吸附剂人人IgGIgG抗体抗体Protein AProtein A羊抗人羊抗人IgGIgG 因此，在运用间接法因此，在运用间接法ELISAELISA进展进展IgMIgM检检测

2、前运用类风湿因子吸附剂对血清作预测前运用类风湿因子吸附剂对血清作预处置处置 。1.加样加样2.孵育孵育3.洗涤洗涤4.参与抗原参与抗原孵育孵育5.参与二抗参与二抗孵育孵育6.显色显色捕获法捕获法ELISAELISA试剂的组成试剂的组成ELISA质量控制的目的质量控制的目的获得正确的检验结果。获得正确的检验结果。使不同时间和地点的使不同时间和地点的ELISA检验结果检验结果具有可比较性。具有可比较性。ELISA准确度的影响要素准确度的影响要素患病率患病率在检测真正感染疾病患者中，检测的在检测真正感染疾病患者中，检测的准确度随着该传染病在人群中的患病准确度随着该传染病在人群中的患病率的变化而改动。

3、率的变化而改动。患病率越高，被检测者阳性是真阳性患病率越高，被检测者阳性是真阳性的能够性就越大。的能够性就越大。 患病率患病率 高高 低低被检测数量被检测数量 10000 10000总阳性数总阳性数 1000 30假阳性数量假阳性数量 27 27真阳性数量真阳性数量 973 3阳性预测值阳性预测值PPV 97.3% 10%PPV=患病率灵敏度/患病率灵敏度+(1-患病率)(1-特异性)100%处理方法处理方法试剂试剂 1试剂试剂 2试剂试剂 1+2敏感度敏感度特异度特异度99.0%99.0%99.5%99.9% (串联串联)患病率患病率PPVPPVPPV0.2%28.4%66.4%99.75%

4、2.0%80.2%80.2%99.97%20.0%98.0%99.6%99.99%ELISA准确度的影响要素准确度的影响要素实验过程实验过程实验操作人员的教育背景和培训实验操作人员的教育背景和培训标本的条件标本的条件实验过程中的对照实验过程中的对照试剂试剂设备设备结果的解释结果的解释结果的誊写和报告结果的誊写和报告ELISA实验过程中涉及的质量控制实验过程中涉及的质量控制仪器仪器n移液器，移液器，ELISA的加样量小，选择量程适宜的的加样量小，选择量程适宜的加样枪，其准确性直接影响实验结果。定期进加样枪，其准确性直接影响实验结果。定期进展校准。展校准。n水浴锅，有外部温度计对仪器温度进展校准。

5、水浴锅，有外部温度计对仪器温度进展校准。n洗板机，残留液体不能使拍干的纸变湿，定期洗板机，残留液体不能使拍干的纸变湿，定期检查加液孔有无堵塞。检查加液孔有无堵塞。n酶标仪，定期检查。酶标仪，定期检查。 ELISA的标本最为常见的是血清浆，有时由于特定的标本最为常见的是血清浆，有时由于特定的检测目的，用到唾液、脑脊液、尿液等标本。的检测目的，用到唾液、脑脊液、尿液等标本。要留意防止出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其要留意防止出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标志酶的为标志酶的ELISA测定中，如血清标本中血红

6、蛋白浓度较高，那么测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，那么其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面参与其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面参与的的HRP底物反响显色。底物反响显色。样本的采集及血清分别中要留意尽量防止细菌污染，一那么样本的采集及血清分别中要留意尽量防止细菌污染，一那么细菌的生长，其所分泌的一些酶能够会对抗原抗体等蛋细菌的生长，其所分泌的一些酶能够会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二那么一些细菌的内源性酶如大肠杆白产生分解作用；二那么一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的菌的-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标志的测定方法半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标志的测定方法产生非特异性干扰

7、。产生非特异性干扰。ELISA实验过程中涉及的质量控制实验过程中涉及的质量控制标本标本血清标本如是以无菌操作分别，那么可以在血清标本如是以无菌操作分别，那么可以在28下下保管一周，如为有菌操作，那么建议冰冻保管。样本保管一周，如为有菌操作，那么建议冰冻保管。样本的长时间保管，应在的长时间保管，应在-70以下。以下。冻存的血清标本须留意防止因停电等呵斥的反复冻融。冻存的血清标本须留意防止因停电等呵斥的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，

8、冻融标本的混匀亦应留意，不要进展猛烈振荡，反复冻融标本的混匀亦应留意，不要进展猛烈振荡，反复颠倒混匀即可。颠倒混匀即可。标本在保管中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，标本在保管中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。应离心沉淀后取上清检测。 p规范操作规程规范操作规程SOPp实验纪录实验纪录p日期日期p操作人员操作人员p试剂批号试剂批号p试剂有效期试剂有效期p试剂预备，运用前在室温平衡试剂预备，运用前在室温平衡20min以上，以以上，以便在温育时很快到达反响要求温度，防止弱便在温育时很快到达反响要求温度，防止弱阳性标本产生假阴性结果。阳性标本产生假阴性结果。p水浴水浴E

9、LISA实验过程中涉及的质量控制实验过程中涉及的质量控制其它其它p试剂盒的阴性和阳性对照在控制范围内试剂盒的阴性和阳性对照在控制范围内pELISA板的空白对照板的空白对照OD值在控制范围内值在控制范围内p实验室内部质控血清实验室内部质控血清(In- House Control, IHC)p每次实验都要包括一个实验室质控血清。每次实验都要包括一个实验室质控血清。p可以监测标本处置过程，而试剂质控只能监可以监测标本处置过程，而试剂质控只能监测之后的过程。测之后的过程。p确保每次实验操作的正确性和结果的一致性。确保每次实验操作的正确性和结果的一致性。p尤其是可以监测试剂不同批号之间的差别。尤其是可以

10、监测试剂不同批号之间的差别。p可以做质控图。可以做质控图。ELISA实验过程中涉及的质量控制实验过程中涉及的质量控制内部质控内部质控IQC包括试剂质控和内包括试剂质控和内部质控血清部质控血清搜集新颖的无溶血、无黄疸、无细菌污染的搜集新颖的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清，阳性血清，56加热加热30min灭活。灭活。用用0.45um滤器过滤除去污染物和杂质，用阴滤器过滤除去污染物和杂质，用阴性血清、正常人血清或性血清、正常人血清或PBS缓冲液将搜集的缓冲液将搜集的血清进展一系列稀释。血清进展一系列稀释。检测稀释标本并绘制检测稀释标本并绘制s形规范曲线。形规范曲线。选择选择Cutoff值值1.

11、5至至3倍倍OD值所对应的稀释度，值所对应的稀释度，作为作为IHC。一次预备一次预备12个月运用量，分装到血清管，每个月运用量，分装到血清管，每管管30ul，于，于-20保管备用。保管备用。 在常规实验条件下，将在常规实验条件下，将IHC放在常规样本中，放在常规样本中，进展进展20次检测，计算均值和规范差次检测，计算均值和规范差SD。并。并绘制质控图。绘制质控图。2SD是普通公认的允许误差限制。是普通公认的允许误差限制。每批测定放一份质控血清时：每批测定放一份质控血清时：一次超越一次超越2SD但小于但小于3SD作为作为 “告警告警一次超出一次超出3SD、延续二次超出、延续二次超出2SD、3-5

12、次延续处次延续处于一侧的于一侧的2SD之内、之内、57次延续偏向横轴的一次延续偏向横轴的一侧，均为失控侧，均为失控 同一批号试剂和质控血清。同一批号试剂和质控血清。举例：质控图举例：质控图“即刻性质控即刻性质控 只需延续测只需延续测3次，即可对第次，即可对第3次检验结果进展质控。次检验结果进展质控。 即刻法即刻法的建立详细计算方法如下：的建立详细计算方法如下：1)先将测定值从小到大陈列先将测定值从小到大陈列2)计算计算X和和SD。3)计算计算SDI上限和上限和SDI下限值。下限值。4)将将SDI上限、上限、SDI下限值与下限值与SDI值中的数字比较。值中的数字比较。 当当 SDI上限值和上限值

13、和SDI下限值下限值n2SD时，表示处于时，表示处于控制范围内，可以继续往下测定，继续反复以上控制范围内，可以继续往下测定，继续反复以上各项计算；当各项计算；当SDI上限和上限和SDI 下限有一值处于下限有一值处于n2SD和和n2SD值之间时，阐明该值在值之间时，阐明该值在2SD3SD范范围，处于围，处于“告警形状；当告警形状；当SDI上限和上限和SDI下限有下限有一值一值 n3SD时，阐明该值已在时，阐明该值已在3SD范围之外，范围之外，属属“失控。数值处于失控。数值处于“告警和告警和“失控形状应失控形状应舍去，重新测定。舍去，重新测定。Nn3sn2snn3sn2s31.151.1512 2

14、.552.2941.491.46132.612.3351.751.67142.662.3761.941.82152.702.4172.101.94162.752.4482.222.0317 2.792.4792.32 2.1118 2.822.50102.412.18192.85 2.53112.482.23 202.882.56SI值表值表 ELISA实验过程中涉及的质量控制实验过程中涉及的质量控制外部质控外部质控ELISA实验中的外部质控实验中的外部质控(EQA) 用于延续地、客观地评价不同实验室之间的检测结果，用于延续地、客观地评价不同实验室之间的检测结果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差别，并协助校正，使具有可比性。主要控制实验结果的差别，并协助校正，使具有可比性。主要控制实验结