第三章-紫外可见分光光度法

1、第三章第三章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法123测量条件的选择测量条件的选择紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计基本原理基本原理分析方法分析方法应用与示例应用与示例 紫外紫外-可见吸收光谱的产生可见吸收光谱的产生紫外紫外-可见吸收光谱与分子结构的关系可见吸收光谱与分子结构的关系测量条件的选择及显色反应测量条件的选择及显色反应基本原理基本原理依据：被测物依据：被测物分子分子对紫外对紫外-可见光的可见光的选择吸收选择吸收特性特性应用：确定物质的组成、含量、推测物质结构应用：确定物质的组成、含量、推测物质结构入射光入射光I0透射光透射光ItLambert-Beer定律定律abcTIIAlg

2、lg0基本原理基本原理本质：分子价本质：分子价电子能级电子能级跃迁跃迁同时伴随振动、转动能级的跃迁同时伴随振动、转动能级的跃迁紫外紫外- -可见吸收光谱的产生可见吸收光谱的产生基本原理基本原理带状光谱、电子光谱带状光谱、电子光谱波长范围：波长范围：100-800 nm-远紫外光区远紫外光区: 100-200nm -近紫外光区近紫外光区: 200-400nm-可见光区可见光区:400-800nm电子跃迁与分子吸收光电子跃迁与分子吸收光谱谱物质分子内部三种运动形式物质分子内部三种运动形式电子相对于电子相对于原子核运动原子核运动电子能级电子能级原子在其平衡位原子在其平衡位置附近相对振动置附近相对振动

3、振动能级振动能级分子本身绕分子本身绕其重心转动其重心转动转动能级转动能级分子的内能：分子的内能：EEe+Ev+Erevr电子能量电子能量Ee 振动能量振动能量Ev转动能量转动能量Er基本原理基本原理能级跃迁能级跃迁电子光谱中总包含振动电子光谱中总包含振动和转动能级跃迁产生的和转动能级跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带若干谱线而呈现宽谱带紫外紫外-可见可见电子光谱电子光谱 Ee =1-20 eV红外红外振动光谱振动光谱 0.05-1 eV远红外远红外转动光谱转动光谱0.005-0.05 eV电子能级跃迁电子能级跃迁振动能级跃迁振动能级跃迁转动能级跃迁转动能级跃迁基本原理基本原理物质对光的选择性吸收及

4、吸收曲线物质对光的选择性吸收及吸收曲线M+热热M+荧光或磷光荧光或磷光M + h M*基态基态 激发态激发态 E1 （ E） E2 E =E2-E1 =h （量子化（量子化 、选择性吸收）、选择性吸收）基本原理基本原理吸收曲线的讨论吸收曲线的讨论不同浓度的同一物质，吸收曲线形状相似、不同浓度的同一物质，吸收曲线形状相似、max不变不变吸收曲线提供结构信息，并作为定性分析依据之一吸收曲线提供结构信息，并作为定性分析依据之一同一物质对不同波长的光吸光度不同同一物质对不同波长的光吸光度不同-选择性吸收选择性吸收基本原理基本原理不同波长单色光不同波长单色光照射，测吸光度照射，测吸光度吸收曲线吸收曲线最

5、大吸收波长最大吸收波长 max吸光度最大吸光度最大处对应波长处对应波长max处吸光度随浓度变化幅度最大处吸光度随浓度变化幅度最大-最灵敏最灵敏不同浓度的同一物质不同浓度的同一物质max处吸光度差异最大处吸光度差异最大-定量分析依据定量分析依据吸收曲线是定量分析中吸收曲线是定量分析中选择入射光波长选择入射光波长的重要依据的重要依据基本原理基本原理紫外紫外- -可见吸收光谱与分子结构的关系可见吸收光谱与分子结构的关系 有机化合物有机化合物UV-Vis光谱是三种价电子跃迁的结果光谱是三种价电子跃迁的结果成键轨道成键轨道反键轨道反键轨道主要有四种跃迁主要有四种跃迁所需能量所需能量大小顺序为：大小顺序为

6、：n n COHnpsHsp*s*RKE,Bnp E分子轨道理论分子轨道理论外层电子外层电子处于分子轨道的基态，即成键轨道或非键轨道处于分子轨道的基态，即成键轨道或非键轨道吸收紫外或可见辐射后吸收紫外或可见辐射后从基态向激发态从基态向激发态( (反键轨道反键轨道) )跃迁跃迁基本原理基本原理分子轨道分子轨道两个原子靠近结合成分子时：两个原子靠近结合成分子时：两个原子轨道线性组合成两个分子轨道两个原子轨道线性组合成两个分子轨道11基本原理基本原理反键轨道能级高于原来原子状态的能级反键轨道能级高于原来原子状态的能级成键轨道能级低于原来原子状态的能级成键轨道能级低于原来原子状态的能级n电子的能级基本

7、上保持原来原子状态的能级电子的能级基本上保持原来原子状态的能级12分子轨道分子轨道成键轨道：低能量成键轨道：低能量、反键轨道：高能量反键轨道：高能量*、*非键轨道：非键轨道：n基本原理基本原理1. 跃迁跃迁所需能量最大所需能量最大 电子吸收远紫外能量电子吸收远紫外能量吸收波长吸收波长200nm的光的光与生色团相连时发生与生色团相连时发生n-共轭作用共轭作用增强生色团生色能力增强生色团生色能力使吸收波长向使吸收波长向长波长波方向移动，且方向移动，且吸收强度增加吸收强度增加生色团与助色团和吸收带生色团与助色团和吸收带基本原理基本原理3.吸收带（吸收带（absorption band）：）：吸收峰在

8、紫外吸收峰在紫外-可见光谱中的波带位置可见光谱中的波带位置根据产生跃迁的价电子和轨道的不同，分为四种类型：根据产生跃迁的价电子和轨道的不同，分为四种类型：共轭体系中共轭体系中*跃迁所产生的吸收带跃迁所产生的吸收带吸收峰位于吸收峰位于217280nm 跃迁所需能量大跃迁所需能量大吸收强度较大吸收强度较大通常通常104 Lmol-1cm-1波长随共轭体系加长向波长随共轭体系加长向长波长波移动，移动，吸收强度吸收强度随之随之加强加强应用最多的吸收带应用最多的吸收带用于用于判断化合物的共轭结构判断化合物的共轭结构由由n *跃迁所产生的吸收带跃迁所产生的吸收带吸收峰位于吸收峰位于200400nm强度较弱

9、强度较弱一般一般104 Lmol-1cm-1 E2带带-204nm，较强吸收，较强吸收， 103 Lmol-1cm-1芳香族化合物的芳香族化合物的*跃迁产生的跃迁产生的精细结构吸收带精细结构吸收带吸收峰位于吸收峰位于230270nm102 Lmol-1cm-1（3）B吸收带（源自德文吸收带（源自德文Benzenoid “苯苯”）判断芳香族化合物判断芳香族化合物苯环上有取代基且与苯环共轭或在极性溶剂中测定时，精细结构简单化/消失（4）E吸收带吸收带基本原理基本原理苯：苯：E1带带180 184nm; =47000E2带带200 204 nm; =7000 max(nm) max苯苯254200甲

10、苯甲苯261300间二甲苯间二甲苯2633001，3，5-三甲苯三甲苯266305六甲苯六甲苯272300苯环共扼双键苯环共扼双键p pp p*跃迁跃迁p pp p*与与苯环振动引起苯环振动引起含取代基时含取代基时B带简化并红移带简化并红移B带带230-270 nm , =200基本原理基本原理羰基双键与苯环共扼：羰基双键与苯环共扼：K带强带强苯的苯的E2带与带与K带合并且红移带合并且红移取代基使取代基使B带简化带简化氧的孤对电子氧的孤对电子R带跃迁受阻，强度弱带跃迁受阻，强度弱CCH3Onp p*R带带p pp p*K带带E带常与带常与K带合并且向长波方向移动带合并且向长波方向移动B带精细结

11、构简单化，吸收强度增加且向长波方向移动带精细结构简单化，吸收强度增加且向长波方向移动苯环上有发色团且与苯环共轭时苯环上有发色团且与苯环共轭时基本原理基本原理25吸收吸收带带跃迁类型跃迁类型吸收峰区域吸收峰区域强度强度产生产生基团基团特点特点Rn* 250500nm弱弱COCNNO2 1.强吸收峰在附近时，强吸收峰在附近时，R带红移或被掩盖带红移或被掩盖2.溶剂极性溶剂极性，R带蓝移带蓝移K* 210250nm强强CC 大大共轭共轭1.共轭双键数目共轭双键数目，K红移，红移，2.K带不被其它带掩蔽，只会掩蔽其它带带不被其它带掩蔽，只会掩蔽其它带B苯环骨架振苯环骨架振动动 * 230270n重心在

12、重心在256nm弱弱1.芳环特征吸收带芳环特征吸收带2.五指峰，有五指峰，有K带时迭合成肩峰带时迭合成肩峰E1E2*苯环中三个苯环中三个CHCH组成的环状组成的环状共轭系统共轭系统180nm200nm强强中强中强1.E1带紫外中看不见，不考虑带紫外中看不见，不考虑2.当苯环上有共轭发色团取代时，当苯环上有共轭发色团取代时，E2带带与与K带合并、长移，带合并、长移，B带同时长移带同时长移3.苯环上有助色团取代，苯环上有助色团取代，E2带红移，但带红移，但仍仍210nm基本原理基本原理红移与蓝移（紫移）红移与蓝移（紫移）减小减小-减色效应减色效应max向向长长波方向移动波方向移动-红移红移向向短短

13、波方向移动波方向移动-蓝移蓝移/紫移紫移 吸收强度即摩尔吸光系数吸收强度即摩尔吸光系数增大增大-增色效应增色效应基本原理基本原理体系体系pH值值溶剂效应溶剂效应位阻效应位阻效应跨环效应跨环效应影响吸收影响吸收带的因素带的因素影响紫外影响紫外- -可见吸收光谱的因素可见吸收光谱的因素基本原理基本原理主要取决于分子中价电子的能级跃迁主要取决于分子中价电子的能级跃迁分子的内部结构和外部环境也会产生影响分子的内部结构和外部环境也会产生影响位阻效应位阻效应异构现象异构现象溶剂异构溶剂异构顺反异构顺反异构共轭异构共轭异构空间位阻空间位阻基本原理基本原理（1）共轭效应）共轭效应-发色团之间发色团之间大大键形

14、成键形成能级间能量差减小能级间能量差减小跃迁所需能量降低跃迁所需能量降低吸收峰向长波方向移动（吸收峰向长波方向移动（红移红移）吸收强度增大（吸收强度增大（摩尔吸收系数变大摩尔吸收系数变大）在单键、双键相互交替的共轭体系（以及其他类型的共轭体系）中，在单键、双键相互交替的共轭体系（以及其他类型的共轭体系）中，由于分子中原子间特殊的相互影响，使分子更稳定，内能更小，键由于分子中原子间特殊的相互影响，使分子更稳定，内能更小，键长趋于平均化的效应。长趋于平均化的效应。例如，普通CC双键键长为1.34埃，CC单键为1.54埃，苯分子中由于相邻的键电子轨道的交迭而成共轭，使其6个C-C键的键长都是1.39

15、埃 基本原理基本原理空间位阻空间位阻助色团与发色团相连时：助色团与发色团相连时：助色团的助色团的n电子与发色团的电子与发色团的电子共轭电子共轭吸收峰红移，吸收强度增加吸收峰红移，吸收强度增加如乙烯：如乙烯： max=162nm（2）助色效应）助色效应基本原理基本原理存在于烷基连接在不饱和键上的化合物中存在于烷基连接在不饱和键上的化合物中烷基的烷基的电子与共轭体系中的电子与共轭体系中的电子共轭电子共轭吸收峰向长波移动，吸收强度增加吸收峰向长波移动，吸收强度增加（3）超共轭效应）超共轭效应超共轭效应大小由烷基中超共轭效应大小由烷基中 -H 原子数目决定原子数目决定甲基最强甲基最强超共轭效应比正常共

16、轭效应弱超共轭效应比正常共轭效应弱影响远远小于共轭效应影响远远小于共轭效应基本原理基本原理若若2个发色团由于立体位阻，妨碍它们处于同一平面，共轭效应减弱。个发色团由于立体位阻，妨碍它们处于同一平面，共轭效应减弱。CCHHCCHH顺式顺式 max=280nm; max=10500反式反式 max=295 nm; max=29000 H3CCH2CCOEtOOH3CCHCCOEtOHO 酮式酮式 max=204 nm 烯醇式烯醇式 max=243 nm 顺式结构有立体位阻顺式结构有立体位阻基本原理基本原理发色团发色团共轭：发色团发色团共轭：33max (nm) 247 253 17000 1900

17、0 max (nm) 237 231 227（肩峰）（肩峰） 10250 5600 邻位取代基邻位取代基 ，连接两个苯环的单键扭转，两个苯环不在同一平面，连接两个苯环的单键扭转，两个苯环不在同一平面不能有效共轭不能有效共轭吸收峰蓝移吸收峰蓝移异构现象异构现象使紫外吸收带产生明显差异使紫外吸收带产生明显差异-不同异构体使紫外吸收光谱及不同异构体使紫外吸收光谱及max、均不同均不同-原因：原因：1.异构延长了共轭体系异构延长了共轭体系2.异构产生了位阻异构产生了位阻3.异构体存在形式与溶剂有关异构体存在形式与溶剂有关3435顺反异构顺反异构CCHHCCHH顺式结构有立体位阻顺式结构有立体位阻二苯乙

18、烯顺反式异构体的紫外吸收光谱二苯乙烯顺反式异构体的紫外吸收光谱OO共轭异构共轭异构鸯尾酮鸯尾酮共轭体系大共轭体系大 H3CCH2CCOEtOOH3CCHCCOEtOHO酮式酮式 max=204 nm烯醇式烯醇式 max=243 nm 鸯尾酮鸯尾酮共轭体系小共轭体系小 37乙酰乙酸乙酯的互变异构体乙酰乙酸乙酯的互变异构体CHCH3COHCOC H25O2CHCCOOCH3OC H25OOHOOHHOOHH与与H2O形成分子间氢键形成分子间氢键结构较稳定结构较稳定 自身形成分子内氢键自身形成分子内氢键结构更稳定结构更稳定基态能量基态能量E酮式（极性溶剂中）酮式（极性溶剂中）烯醇式（非极性溶剂中）烯

19、醇式（非极性溶剂中）max(nm) 272（ n*）243 （*） 弱弱 强强溶剂异构溶剂异构跨环效应跨环效应指指非共轭基团非共轭基团之间的相互作用之间的相互作用发色团发色团处于一定的空间位置（环状体系）处于一定的空间位置（环状体系）分子轨道间相互作用分子轨道间相互作用产生光谱产生光谱既非两个发色团加合，也非二者共轭既非两个发色团加合，也非二者共轭39 二环庚烯（孤立双键）二环庚烯（孤立双键） max197 7600 二环庚二烯（两个非共轭双键）二环庚二烯（两个非共轭双键）在在200-230nm有弱、具精细结构的吸收带有弱、具精细结构的吸收带205，214，220，230（肩峰）（肩峰）210

20、0，214，870，200 分子中两个双键相互平行分子中两个双键相互平行 空间位置有利于相互作用空间位置有利于相互作用 羰基与乙烯基的相互作用的跨环效应羰基与乙烯基的相互作用的跨环效应某些某些、不饱和酮中，适当的立体排列使羰基氧的孤电子不饱和酮中，适当的立体排列使羰基氧的孤电子对和双键的对和双键的电子发生作用：电子发生作用：n*引起的引起的R吸收带长移、吸收带长移、40 (a) (b) (c)OOOOOmax (nm) 296 233，296，307 225，275 32 2290，307，267 1200，33 41S.COH2CO.溶剂的极性强弱吸收峰的波长、吸收强度以及形状溶剂的极性强弱

21、吸收峰的波长、吸收强度以及形状测定光谱一般应注明所用溶剂测定光谱一般应注明所用溶剂溶剂极性对溶剂极性对n*和和*跃迁产生吸收峰的位置有不同影响：跃迁产生吸收峰的位置有不同影响： max(正己烷正己烷) max(氯仿氯仿) max(甲醇甲醇) max(水水)pppp*230238237243npp*329315309305异亚丙基丙酮的溶剂效应异亚丙基丙酮的溶剂效应溶剂极性溶剂极性 n p p*跃迁：蓝移、跃迁：蓝移、 、p p p p*跃迁：红移、跃迁：红移、 、基本原理基本原理可用以可用以区别两种跃迁区别两种跃迁引起的吸收谱带引起的吸收谱带溶剂效应溶剂效应1：乙醚2：水12250300苯酰丙

22、酮苯酰丙酮 非极性非极性 极性极性n p p*跃迁：蓝移、跃迁：蓝移、 、 p p p p*跃迁：红移、跃迁：红移、 、极性溶剂使精细结构消失极性溶剂使精细结构消失基本原理基本原理基本原理基本原理46溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸收峰的影响溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸收峰的影响跃迁跃迁类型类型正己烷正己烷氯仿氯仿甲醇甲醇水水迁移迁移*230nm238nm237nm243nm长移长移n*329nm315nm309nm305nm短移短移在溶解度允许范围内尽可能选用在溶解度允许范围内尽可能选用非极性溶剂或极性小非极性溶剂或极性小的溶剂的溶剂原则原则对酸性、碱性的样品有明显影响对酸性、碱性的样品

23、有明显影响引起吸收峰位置、吸收强度和光谱形状改变引起吸收峰位置、吸收强度和光谱形状改变47体系体系pH值的影响值的影响OHOH-H+O-max 211，270 235，287 6200，1450 9400，2600酚羟基存在酚羟基存在吸收峰在碱性介质中红移、吸收强度增加吸收峰在碱性介质中红移、吸收强度增加 滴加滴加HCl溶液，吸收峰位置和强度复原溶液，吸收峰位置和强度复原据此推断芳香族化合物是否有羟基直接连苯环据此推断芳香族化合物是否有羟基直接连苯环48max 230，280 203，254 8600，1470 7500，160NH2OH-H+NH3+苯：苯： max(nm) 200, 255

24、 8000, 215N上未成对电子与上未成对电子与H离子形成配位键后离子形成配位键后 吸收光谱与苯类似吸收光谱与苯类似用该法鉴别苯胺及其衍生物用该法鉴别苯胺及其衍生物 1. 方法灵敏度较高方法灵敏度较高 一般可测到一般可测到104105g/ml 部分可达部分可达107g/ml 2. 测定准确度较高测定准确度较高 一般为一般为 0.50.23. 不能表现整个分子的特征不能表现整个分子的特征主要反映分子中发色团、助色团及其共轭的情况主要反映分子中发色团、助色团及其共轭的情况单独用紫外光谱不能确定化合物的分子结构单独用紫外光谱不能确定化合物的分子结构必须与红外、核磁共振和质谱等配合必须与红外、核磁共

25、振和质谱等配合49紫外紫外- -可见分光光度法特点可见分光光度法特点基本原理基本原理小结小结50常用术语常用术语吸收曲线（吸收光谱）吸收曲线（吸收光谱）吸收峰、吸收谷吸收峰、吸收谷最大最大/小吸收波长（小吸收波长（max /min）吸收曲线上的吸收峰吸收曲线上的吸收峰/谷对应波长谷对应波长肩峰（肩峰（sh）吸收曲线上一个吸收峰旁边产生的一个曲折吸收曲线上一个吸收峰旁边产生的一个曲折末端吸收末端吸收 吸收曲线上短波端只呈现强吸收而不成峰形的部分吸收曲线上短波端只呈现强吸收而不成峰形的部分强带强带 紫外可见光谱中摩尔吸光系数紫外可见光谱中摩尔吸光系数104的吸收峰的吸收峰弱带弱带 紫外可见光谱中摩

26、尔吸光系数紫外可见光谱中摩尔吸光系数103的吸收峰的吸收峰生色团生色团 含有含有*或或n*跃迁的基团，在紫外可见光范围产生吸收跃迁的基团，在紫外可见光范围产生吸收助色团助色团 含杂原子的饱和基团，可使吸收峰红移、吸收强度增加含杂原子的饱和基团，可使吸收峰红移、吸收强度增加蓝移（紫移、短移）蓝移（紫移、短移） 、红移（长移）、红移（长移） 浓浓/淡色效应淡色效应 吸收强度增加吸收强度增加/减弱的效应减弱的效应基本原理基本原理51基本原理基本原理 基本组成基本组成仪器类型仪器类型紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计仪器校正仪器校正紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计光源光源单色器单色器吸收池吸

27、收池检测器检测器显示显示基本组成基本组成紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱有足够的辐射强度、较好稳定性、较长使用寿命有足够的辐射强度、较好稳定性、较长使用寿命1.光源光源-钨灯作为光源钨灯作为光源-辐射波长范围在辐射波长范围在3202500 nm可见光区：可见光区：-氢、氘灯作为光源氢、氘灯作为光源-辐射波长范围在辐射波长范围在185400 nm紫外区：紫外区：紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计 2.单色器单色器将光源发射的复合光分解成单色光将光源发射的复合光分解成单色光并中选出一任波长单色光并中选出一

28、任波长单色光光学系统光学系统 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计 入射狭缝：光源的光由此进入单色器入射狭缝：光源的光由此进入单色器准光装置：透镜或反射镜使入射光成为平行光束准光装置：透镜或反射镜使入射光成为平行光束 色散元件：将复合光分解成单色光色散元件：将复合光分解成单色光-棱镜或光栅棱镜或光栅聚焦装置：透镜或凹面反射镜将单色光聚焦至出射狭缝聚焦装置：透镜或凹面反射镜将单色光聚焦至出射狭缝出射狭缝出射狭缝入射入射狭缝狭缝准直准直透镜透镜棱棱镜镜聚焦聚焦透镜透镜出射出射狭缝狭缝白光白光红红紫紫12800 600 500400紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计3.样品室样品室放置各种类型

29、放置各种类型吸收池（比色皿）吸收池（比色皿）和相应池架附件和相应池架附件石英池石英池玻璃池玻璃池紫外区紫外区可见区可见区吸收池厚度（吸收池厚度（L）规格：）规格：0.5、1、2、3cm注意：保持注意：保持透光面光洁透光面光洁紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计定量分析前吸收池需作配对：定量分析前吸收池需作配对：%.50样品池参比池TT紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计4.检测器检测器用用光电效应光电效应将透过吸收池的光信号变成可测电信号将透过吸收池的光信号变成可测电信号类型：光电池类型：光电池/管、光电倍增管、管、光电倍增管、光二极管阵列光二极管阵列紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计

30、61紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计检流计、数字显示、微机进检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理行仪器自动控制和结果处理5. 结果显示记录系统结果显示记录系统将检测器输出的微弱电信号加以放大显示将检测器输出的微弱电信号加以放大显示显示方式：显示方式：透光率、吸光度、浓度、吸光系数、吸收曲线透光率、吸光度、浓度、吸光系数、吸收曲线(光谱光谱)紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计分光光度计的类型分光光度计的类型结构简单，价格便宜结构简单，价格便宜在给定波长处测在给定波长处测A或或T，不能作全波段光谱扫描，不能作全波段光谱扫描适用于定量分析，不适用于定性分析适用于定量分析，不适用

31、于定性分析结果受光源的波动影响较大结果受光源的波动影响较大 要求光源和检测器具有很高的稳定性要求光源和检测器具有很高的稳定性1.1.单光束单光束紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计仪器复杂，价格较高仪器复杂，价格较高快速全波段扫描、自动记录快速全波段扫描、自动记录适用于定量分析、定性分析和结构分析适用于定量分析、定性分析和结构分析可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素影响可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素影响自动比较透过自动比较透过参比溶液参比溶液和和样品溶液样品溶液的光强度的光强度2.双光束双光束紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计将将不同波

32、长的两束单色光（不同波长的两束单色光（1、2） 快速交替通过快速交替通过同一吸收池同一吸收池而后到达检测器而后到达检测器-无需参比池无需参比池 = 12nm两波长同时扫描即可获得导数光谱两波长同时扫描即可获得导数光谱3.双波长双波长紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计三种不同类型分光光度计比较三种不同类型分光光度计比较紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计68波长范围波长范围 195820nm波长准确度波长准确度 显示波长与实际波长的误差显示波长与实际波长的误差0.5nm 波长重现性波长重现性 重复同一波长的变动值重复同一波长的变动值0.5nm 透光率测量范围透光率测量范围 0150%(T)

33、吸光度测量范围吸光度测量范围 0.17302.00（A）光度准确度光度准确度 透光率满量程误差为透光率满量程误差为 0.5 光度重复性光度重复性 重复测量透光率的变动性重复测量透光率的变动性 0.5分辨率分辨率 单色器分辨相近谱线的能力单色器分辨相近谱线的能力 0.3nm（260nm）杂散光杂散光 1%NaI(220nm) 0.5% 仪器光学性能仪器光学性能紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计-溶剂、参比或样品溶液溶剂、参比或样品溶液123波长校正波长校正 吸光度校正吸光度校正吸收池校正吸收池校正-氢灯、氘灯发射谱线氢灯、氘灯发射谱线-镨钕玻璃、钬玻璃镨钕玻璃、钬玻璃-苯蒸气苯蒸气-硫酸铜标

34、准溶液硫酸铜标准溶液-硫酸钴铵标准溶液硫酸钴铵标准溶液-铬酸钾标准溶液铬酸钾标准溶液分光光度计的校正分光光度计的校正紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计双波长分光光度法21XAY21AAA）（yxyxAAAA2211)(yyAA21xxAAA21xxxbCA）（21Y 的存在不干扰 X 的测定 光度法的误差光度法的误差显色反应与显色条件显色反应与显色条件光度法的干扰光度法的干扰测量条件的选择测量条件的选择测量条件的选择测量条件的选择显色反应类型显色反应类型显色反应条件的选择显色反应条件的选择显色反应与显色条件显色反应与显色条件测量条件的选择测量条件的选择显色反应的基本要求显色反应的基本要求1

35、234很多物质本很多物质本身无吸收或身无吸收或只有弱吸收只有弱吸收紫外紫外-可见光区：可见光区：需在一定需在一定条件下加条件下加入入显色剂显色剂经经显色反应显色反应将被测组分将被测组分转变为有色转变为有色化合物化合物测定该测定该化合物化合物测量条件的选择测量条件的选择显色反应显色反应选用适当的试剂与不吸收紫外选用适当的试剂与不吸收紫外-可见光的被测物可见光的被测物定量反应定量反应生成对紫外生成对紫外-可见光有较大吸收的物质的反应可见光有较大吸收的物质的反应 显色剂显色剂与不吸收紫外与不吸收紫外-可见光的被测物定量反应生成对紫外可见光的被测物定量反应生成对紫外-可可见光有较大吸收的物质的试剂见光

36、有较大吸收的物质的试剂74测量条件的选择测量条件的选择有机显色剂：有机显色剂：与金属生成稳定螯合物与金属生成稳定螯合物含有生色团和助色团：对光的最大吸收向长波方向移动含有生色团和助色团：对光的最大吸收向长波方向移动偶氮类（偶氮类（- N=N-）显色剂：应用最广泛）显色剂：应用最广泛本身是有色物质本身是有色物质生成配合物后颜色发生明显变化生成配合物后颜色发生明显变化显色反应灵敏度高显色反应灵敏度高选择性好选择性好性质稳定性质稳定对比度大对比度大无机显色剂：无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等测量条件的选择测量条件的选择铬天青铬天青S邻二氮菲邻二氮菲二苯硫腙二苯硫腙

37、丁二酮肟丁二酮肟 磺基水杨酸磺基水杨酸 测量条件的选择测量条件的选择反应定量：反应定量：被测组分和生成物质之间的关系确定被测组分和生成物质之间的关系确定选择性高选择性高生成物稳定生成物稳定灵敏度高：灵敏度高：生成物的生成物的需达到需达到103105无干扰：无干扰：显色剂在测定波长处无明显吸收显色剂在测定波长处无明显吸收对比度：对比度：生成物与显色剂的生成物与显色剂的 max之差之差 60nm显色反应的要求显色反应的要求测量条件的选择测量条件的选择可利用的显色反应种类：配合、氧化还原、可利用的显色反应种类：配合、氧化还原、络合络合1）络合反应：）络合反应：2）氧化还原：）氧化还原： 测测Mn或或

38、Cr时，可用氧化剂将其氧化为时，可用氧化剂将其氧化为 比色比色SCNHNNC6H5NHC6H5221PbSCNHNC6H5NNPb/2C6H5 H2724,OCrMnO显色反应类型显色反应类型测量条件的选择测量条件的选择显色反应条件的选择显色反应条件的选择-通过实验确定通过实验确定1）显色剂用量）显色剂用量 吸光度吸光度A与显色剂用量与显色剂用量CR的关系：的关系：选择曲线变化平坦处对应浓度选择曲线变化平坦处对应浓度恒定吸光度值时恒定吸光度值时测量条件的选择测量条件的选择2）反应体系的酸度）反应体系的酸度相同实验条件下，分别测定不同相同实验条件下，分别测定不同pH值条件下显色溶液的吸光度值条件

39、下显色溶液的吸光度A 很多显色剂是有机弱酸或弱碱很多显色剂是有机弱酸或弱碱溶液酸度影响显色剂存在形式溶液酸度影响显色剂存在形式有色化合物浓度变化，溶液颜色改变有色化合物浓度变化，溶液颜色改变对氧化还原反应、缩合反应等溶液的酸碱性也有重要影响对氧化还原反应、缩合反应等溶液的酸碱性也有重要影响用缓冲溶液保持溶液在一定用缓冲溶液保持溶液在一定pH值下进行显色反应值下进行显色反应选择曲线中吸光度选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区较大且恒定的平坦区所对应的所对应的pH范围范围测量条件的选择测量条件的选择813）显色时间）显色时间显色反应的反应速度显色反应的反应速度时间时间一定条件下通过实验作吸收度时间关

40、系曲线一定条件下通过实验作吸收度时间关系曲线显色产显色产物颜色物颜色保持长时间不变保持长时间不变逐渐减退或加深逐渐减退或加深一定时间才显色一定时间才显色确定适宜显色时间确定适宜显色时间测量条件的选择测量条件的选择82显色反应是化学反应显色反应是化学反应温度温度原花青素与盐酸亚铁铵在硫酸原花青素与盐酸亚铁铵在硫酸/ /丙酮溶剂中的显色反应丙酮溶剂中的显色反应室温：显色产物吸收度极低室温：显色产物吸收度极低煮沸：显色产物吸收度明显增大煮沸：显色产物吸收度明显增大4）显色温度）显色温度 5）溶剂）溶剂- -溶剂性质直接影响溶剂性质直接影响被测组分被测组分对光的吸收对光的吸收 苦味酸的水溶液呈黄色，氯

41、仿液呈无色苦味酸的水溶液呈黄色，氯仿液呈无色- -显色显色反应产物反应产物的稳定性与溶剂有关的稳定性与溶剂有关 红色的硫氰酸铁配合物在丁醇中比在水溶液中稳定红色的硫氰酸铁配合物在丁醇中比在水溶液中稳定- -一般尽量采用一般尽量采用水相水相测定测定 测量条件的选择测量条件的选择干扰现象干扰现象干扰物质对显色反应和测定的影响干扰物质对显色反应和测定的影响1.干扰物质本身有色干扰物质本身有色/无色但与显色剂形成有色化合物无色但与显色剂形成有色化合物83光度法的干扰光度法的干扰2.干扰物质水解干扰物质水解析出沉淀使溶液混浊析出沉淀使溶液混浊3.干扰物质水解与被测组分或显色剂形成更稳定的配合物干扰物质水

42、解与被测组分或显色剂形成更稳定的配合物在测定条件下有吸收在测定条件下有吸收显色反应不能进行完全显色反应不能进行完全测量条件的选择测量条件的选择消除干扰的方法消除干扰的方法主要为共存离子主要为共存离子v 控制酸度控制酸度v 选择适当的掩蔽剂选择适当的掩蔽剂v 生成惰性配合物生成惰性配合物v 选择适当的测定波长选择适当的测定波长v 选择适宜的空白溶液选择适宜的空白溶液v 预分离预分离测量条件的选择测量条件的选择v 加入掩蔽剂：加入掩蔽剂：选择掩蔽剂的原则选择掩蔽剂的原则-掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰测定掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反

43、应产物不干扰测定测定测定Ti4，可加入，可加入H3PO4掩蔽剂使掩蔽剂使Fe3+(黄色黄色)成为成为Fe(PO4)23-(无色无色)，消除消除Fe3+的干扰的干扰铬天菁铬天菁S光度法测定光度法测定Al3+时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将Fe3+还原为还原为Fe2+，消除，消除Fe3+的干扰的干扰测量条件的选择测量条件的选择提高测定灵敏度和选择性的途径提高测定灵敏度和选择性的途径1）合成新的高灵敏度有机显色剂）合成新的高灵敏度有机显色剂2）分离富集和测定相结合）分离富集和测定相结合3）采用）采用三元三元(多元多元)配合物配合物显色体系显色体系 多元配合物显色反应具有很高的灵敏

44、度：多元配合物显色反应具有很高的灵敏度：1.多元配合物比其相应的二元配合物分子截面积更大多元配合物比其相应的二元配合物分子截面积更大2.第二第二/三配位体的引入，可能产生配位体之间、配位体与中心金属三配位体的引入，可能产生配位体之间、配位体与中心金属离子间的协同作用离子间的协同作用使共轭使共轭电子的流动性和电子跃迁几率增大电子的流动性和电子跃迁几率增大由一个中心金属离子与两种由一个中心金属离子与两种(或两种以上或两种以上)不同配位体形成的配合物不同配位体形成的配合物测量条件的选择测量条件的选择23 33 1测定波长的选择测定波长的选择吸光度范围的控制吸光度范围的控制空白溶液的选择空白溶液的选择

45、测量条件的选择测量条件的选择测量条件的选择测量条件的选择选择适当的入射波长选择适当的入射波长一般选择一般选择max为入射波长：为入射波长：A ，灵敏度，灵敏度 ，准确度，准确度 若若max处有共存组分干扰，放弃灵敏度、避免干扰处有共存组分干扰，放弃灵敏度、避免干扰选择原则选择原则-吸收最大、干扰最小吸收最大、干扰最小选择不易出现干扰吸收、吸光度较大且峰顶较平坦的波长选择不易出现干扰吸收、吸光度较大且峰顶较平坦的波长测量条件的选择测量条件的选择控制适宜的吸光度（读数范围）控制适宜的吸光度（读数范围）浓度测量的相对误差与透光率浓度测量的相对误差与透光率T 的关系的关系1.测量最适宜范围测量最适宜范

46、围 透光率：透光率：6520 吸光度：吸光度：0.20.72.浓度相对误差最小浓度相对误差最小 透光率：透光率： 36.8% 吸光度：吸光度：0.434T =1%时时通过调节溶液的通过调节溶液的浓度浓度和吸收池的和吸收池的厚度厚度来解决来解决测量条件的选择测量条件的选择 选择合适的空白（参比）溶液选择合适的空白（参比）溶液空白（参比）溶液作用空白（参比）溶液作用校正仪器的透校正仪器的透光率光率100或吸或吸光度光度A为零为零消除来自于溶剂、消除来自于溶剂、试剂、器皿及试试剂、器皿及试样的干扰吸收样的干扰吸收测得的吸光度真正反映待测溶液吸光强度测得的吸光度真正反映待测溶液吸光强度测量条件的选择测

47、量条件的选择常见的空白（参比）溶液常见的空白（参比）溶液 91v 溶剂空白溶剂空白v 试剂空白试剂空白v 试样空白试样空白v 不显色空白不显色空白v 平行操作空白平行操作空白测量条件的选择测量条件的选择溶剂末端吸收溶剂末端吸收以以截止波长截止波长描述描述小于截止波长的辐射通过溶剂小于截止波长的辐射通过溶剂溶剂对辐溶剂对辐射有吸收射有吸收溶剂对测溶剂对测量无干扰量无干扰大于截止波长的辐射通过溶剂大于截止波长的辐射通过溶剂选用溶剂应在样品的吸收光谱区内无明显吸收？选用溶剂应在样品的吸收光谱区内无明显吸收？能够使用的最小波长能够使用的最小波长基本原理基本原理 溶剂装入溶剂装入1cm比色皿比色皿空气为

48、参比空气为参比溶剂的吸溶剂的吸光度光度A=1逐渐降低逐渐降低入射波长入射波长此时的波长称为溶剂的截止波长此时的波长称为溶剂的截止波长中国药典对中国药典对UV法溶剂的要求：以空气为空白，溶剂和吸收池的吸收度在法溶剂的要求：以空气为空白，溶剂和吸收池的吸收度在200240nm范围内不得超过范围内不得超过0.40；241250nm范围内不得超过范围内不得超过0.20251300nm范围内不得超过范围内不得超过0.10；300nm以上不得超过以上不得超过0.05如何确定截止波长？如何确定截止波长？基本原理基本原理 作参比作参比仅待测组仅待测组分在测定分在测定波长处有波长处有吸收吸收纯溶剂纯溶剂试剂空白

49、试剂空白其它试剂其它试剂在测定波在测定波长处略有长处略有吸收，试吸收，试液本身无液本身无吸收吸收试样空白试样空白待测试液待测试液在测定波在测定波长处有吸长处有吸收，而其收，而其它试剂无它试剂无吸收吸收试液试液+掩蔽掩蔽剂剂+显色剂显色剂显色剂、显色剂、试液中其试液中其它组分在它组分在测量波长测量波长处有吸收处有吸收空白（参比）溶液的选择原则空白（参比）溶液的选择原则测量条件的选择测量条件的选择测定波长选择在被测组分最大吸收波长处测定波长选择在被测组分最大吸收波长处测量值吸光度测量值吸光度A在在0.20.7范围内范围内合理选择空白溶液合理选择空白溶液95小结小结测量条件的选择测量条件的选择 定性

50、分析定性分析定量分析定量分析结构分析结构分析分析方法分析方法1.主要依据主要依据 吸收光谱形状吸收光谱形状吸收峰数目吸收峰数目各吸收峰的波长位置各吸收峰的波长位置 吸收强度吸收强度定性分析定性分析分析方法分析方法对比法对比法对比吸收光谱特征数据对比吸收光谱特征数据max对比吸光度（吸光系数）比值对比吸光度（吸光系数）比值A1/A2对比吸收光谱的一致性对比吸收光谱的一致性2.定性鉴别的方法定性鉴别的方法分析方法分析方法99安宫黄体酮（安宫黄体酮（M386.53） 炔诺酮（炔诺酮（M298.43） max2401nm max2401nm 408 571OOHHHCCOCH3CH3OCH3CH3CH

51、3OOHHHCCH3HCH1%1cmE1%1cmE分析方法分析方法100 分析方法分析方法结构完全相同的化合物应有完全相同吸收光谱结构完全相同的化合物应有完全相同吸收光谱吸收光谱相同的化合物不一定是同一个化合物吸收光谱相同的化合物不一定是同一个化合物吸收光谱明显差别的化合物肯定不是同一物质吸收光谱明显差别的化合物肯定不是同一物质101结论结论紫外吸收光谱数据或曲线进行定性鉴别有一定的紫外吸收光谱数据或曲线进行定性鉴别有一定的局限性局限性光谱只有一个或几个宽吸收带，相同或相似的光谱较多光谱只有一个或几个宽吸收带，相同或相似的光谱较多单独用紫外不能确定物质结构，需与单独用紫外不能确定物质结构，需与

52、IR/MS/NMR结合结合分析方法分析方法定量分析定量分析102定量分析依据定量分析依据定量分析方法定量分析方法光吸收定律（光吸收定律（L-B定律）定律）A=KLc1)单组分样品的定量方法单组分样品的定量方法 2)多组分样品的定量方法计算分光光度法多组分样品的定量方法计算分光光度法分析方法分析方法1)单组分样品的定量方法单组分样品的定量方法基本要求基本要求1. 符合符合L-B定律定律 -物质在一定波长处的吸收度与浓度之间呈线性关系物质在一定波长处的吸收度与浓度之间呈线性关系2.被测组分最大吸收波长作测定波长被测组分最大吸收波长作测定波长3. 溶剂在测定波长处无吸收溶剂在测定波长处无吸收103分

53、析方法分析方法104溶剂的极限波长溶剂的极限波长选择溶剂时，被测组分的测定波长必须选择溶剂时，被测组分的测定波长必须大于大于溶剂的截止波长溶剂的截止波长溶剂溶剂极限极限波长波长溶剂溶剂极限极限波长波长溶剂溶剂极限极限波长波长乙醚乙醚21896%硫酸硫酸210氯仿氯仿245环己烷环己烷200乙醇乙醇210四氯化碳四氯化碳260正丁醇正丁醇2102,2,4三甲戊烷三甲戊烷220蚁酸甲酯蚁酸甲酯260水水200对二氧六环对二氧六环220苯苯260异丙醇异丙醇210正己烷正己烷190甲苯甲苯285甲基环己烷甲基环己烷210甘油甘油230吡啶吡啶305二硫化碳二硫化碳3851,2二氧己烷二氧己烷233丙

54、酮丙酮330甲醇甲醇205二氯甲烷二氯甲烷235乙酸乙酯乙酸乙酯260分析方法分析方法单组分样品的定量方法单组分样品的定量方法1051. 标准曲线法标准曲线法2. 标准对照法标准对照法3. 吸光系数法吸光系数法 4. 示差光度法示差光度法分析方法分析方法106（1）标准曲线法）标准曲线法 配制一系列浓度不同的标准溶液配制一系列浓度不同的标准溶液. 分别测其吸收度分别测其吸收度 以浓度为横坐标，相应的吸收度以浓度为横坐标，相应的吸收度为纵坐标，绘制为纵坐标，绘制AC曲线或计算曲线或计算回归方程回归方程 在相同条件下测定样品溶液的吸在相同条件下测定样品溶液的吸光度，从标线上或用回归方程求光度，从标

55、线上或用回归方程求得样品浓度得样品浓度分析方法分析方法107注意事项注意事项标准溶液至少要标准溶液至少要5点点A样样必须包括在标线必须包括在标线范围范围内内样品和对照品须使用样品和对照品须使用相同相同溶剂和显色系统、相同条件测定溶剂和显色系统、相同条件测定固定仪器和方法后，标线可多次使用，但要定期固定仪器和方法后，标线可多次使用，但要定期校正校正影响标准曲线不通过原点的原因影响标准曲线不通过原点的原因 空白溶液的选择不当空白溶液的选择不当显色反应的灵敏度不够显色反应的灵敏度不够吸收池的光学性能不一致吸收池的光学性能不一致 分析方法分析方法108（2）对照法）对照法 相同条件分别测量吸光度：相同

56、条件分别测量吸光度：A标标KLc标标A样样KLc样样 ACAC标标样样注意事项注意事项标准曲线要过原点标准曲线要过原点仪器单色光纯度要高仪器单色光纯度要高C样样与与C标标要接近要接近分析方法分析方法109已知已知 L和吸光系数和吸光系数或或 ，可根据测量值，可根据测量值 A 值求被测物浓度值求被测物浓度注意事项注意事项用用 -c 为为g/100ml用用-c 为为mol/L1%1cmE1%1cmELEL1cm1 %AAc（3）吸光系数法）吸光系数法分析方法分析方法110中药蟾酥中脂蟾毒配基的含量测定中药蟾酥中脂蟾毒配基的含量测定精密称定试样精密称定试样0.472g，索氏提取后，滤液置，索氏提取后

57、，滤液置100ml量瓶中，量瓶中，精密量取精密量取1ml置置25ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度。用量瓶中，加乙醇稀释至刻度。用1cm石英池在石英池在299nm波长处测得吸光度为波长处测得吸光度为0.459，计算脂蟾毒，计算脂蟾毒配基的百分含量。（已知配基的百分含量。（已知E标标154）分析方法分析方法111解：解：法：先求试样中纯品浓度法：先求试样中纯品浓度 试样浓度试样浓度 结果结果20.4721100 1.89 10( /100)10025Cgml样分析方法分析方法112法：先求试样的百分吸光系数法：先求试样的百分吸光系数结果结果 1%120.459()1.89 101cmXE20.4721

58、100 1.89 10( /100)10025Cgml样分析方法分析方法定义：定义：用一与供试品浓度接近的标准溶液，代替空白溶液用一与供试品浓度接近的标准溶液，代替空白溶液作参比，与供试品溶液进行比较的方法作参比，与供试品溶液进行比较的方法基本原理：基本原理：供试品溶液与参比溶液的吸光度供试品溶液与参比溶液的吸光度( A )与两溶液与两溶液的浓度差成正比的浓度差成正比适用范围：适用范围：高含量、稀溶液、高精度高含量、稀溶液、高精度实质：实质：透光率在表尺上的扩展透光率在表尺上的扩展113（4）差示光度法）差示光度法-A法法分析方法分析方法2)多组分样品的定量方法计算分光光度法多组分样品的定量方

59、法计算分光光度法样品中有两种或两种以上组分共存时样品中有两种或两种以上组分共存时根据吸收光谱重叠的情况分别采用不同的测定方法根据吸收光谱重叠的情况分别采用不同的测定方法114第一种：按单组分测定方法第一种：按单组分测定方法第二种：根据吸光度加和性原理计算出第二种：根据吸光度加和性原理计算出b的浓度的浓度Cb 第三种：计算分光光度法第三种：计算分光光度法分析方法分析方法(1)解线性方程组法解线性方程组法(2)双波长分光光度法双波长分光光度法(3)三波长测定法三波长测定法(4)导数光谱法导数光谱法(5)正交函数法正交函数法115计算分光光度法计算分光光度法分析方法分析方法分别测定分别测定a、b两组

60、分在两组分在1和和2处各自的吸光系数处各自的吸光系数E或或。测定测定a、b两组分混合液在两组分混合液在1和和2处的处的A1a+b与与A2a+b解线性方程组法计算出解线性方程组法计算出a、b两组分的浓度两组分的浓度116(1)解线性方程组法解线性方程组法要求两组分浓度相差不大要求两组分浓度相差不大bbaabababbaababaCECEAAACECEAAA1111122222分析方法分析方法等吸收点法等吸收点法系数倍率法系数倍率法117(2)双波长分光光度法双波长分光光度法利用两束不同波长的单色光利用两束不同波长的单色光1和和2，以，以1为参比波长、为参比波长、 2为为测定波长，测定波长，测定同