第11章 色谱分析法概论(新

1、第11章 色谱分析法概论11.1 概述11.2 色谱法基础知识11.3 色谱分离的基本理论11.4 色谱法的发展趋势11.1概述11.1.1色谱法的起源和发展1906年俄国植物学家茨维特 (M.Tswett) 从分离植物色素实验中发明了色谱分离方法。俄国植物学家茨维特色谱色谱法(Chromatography)石油醚(流动相)碳酸钙(固定相)纯组分色谱柱混合色素叶绿素叶黄素胡萝卜素表11-1 色谱法的发展简史年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn, Lederer用氧化铝和碳酸钙分离-,-,-胡萝卜素。色谱法受重视。

2、1938Izmailov, Shraiber最先使用薄层色谱法。Taylor, Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin, Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气相色谱。1944Consden等等发明了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段1952Martin, James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。(1952诺贝尔奖)1956Van Deemter等等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1959Po

3、rath, Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson等等创立了毛细管电泳法。表11-2 色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作年代获奖学科获奖研究工作1937化学胡萝卜素化学，维生素A和B1938化学胡萝卜素化学1939化学聚甲烯和高萜烯化学1950生理学医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离1951化学超铀元素的发现1955化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1

4、958化学胰岛素的结构1961化学光合作用时发生的化学反应的确认1970生理学医学关于神经元触处迁移物质的研究化学发现糖核苷酸及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化学核糖核酸化学酶结构的研究生理学医学抗体结构的研究11.1概述11.1.1色谱法的起源和发展1906，俄国植物学家 M.Tswett 发明色谱法，是色谱之父。1931，对液固吸附色谱的杰出贡献者库恩，分离出60多种胡萝卜素，核黄素、维生素，获1938年诺贝尔化学奖。蒂塞利乌斯(Tiselius)因电泳分析方法的研究，发现血清蛋白组分，获1948年诺贝尔化学奖。1941，马丁(Martin)和辛格(Synge)创始分配色谱特别是纸

5、色谱而共获1952年诺贝尔化学奖。氨基酸自动分析仪发明人S穆尔(Stanford Moore)和W.H.斯坦(William Howard Stein),定量分析方法解决了有关氨基酸、多肽、蛋白质等复杂的生物化学问题，获1972年诺贝尔化学奖。色谱法又称层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质(样品)与固定相和流动相之间的弱作用力(静电力、诱导力、色散力和氢键)的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次“平衡”，实现差速移行，使各溶质达到相互分离。固定相：在色谱分离中固定不动，对组分产生保留的作用一相。流动相：带动组分向前移动的另一相，与固定相处于平衡状态。分离对象：各组分分子之

6、间的结构相似、性质相近的混合样品。11.1概述 11.1.2色谱法的定义与分类o定义o分类根据流动相的状态将色谱法分成四大类。表表11-3 色谱法以流动相种类的分类色谱法以流动相种类的分类色谱类型色谱类型流动相流动相主要分析对象主要分析对象气相色谱法气体挥发性有机化合物液相色谱法液体溶于水或有机溶剂的各种物质超临界色谱法超临界流体各种有机化合物电色谱法缓冲溶液、电场离子和各种有机化合物11.1概述 11.1.2色谱法的定义与分类o定义o分类11.1概述 11.1.2色谱法的定义与分类1.按两相分子的聚集状态分类2. 按固定相的固定方式分类柱色谱：填充柱、毛细管柱色谱平面色谱：纸色谱、薄层色谱

7、分配色谱：利用分配系数的不同吸附色谱：利用吸附性能的差异离子交换色谱：利用离子交换能力不同空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同3.按分离的机制分类液相色谱：液-固色谱、液-液色谱气相色谱：气-固色谱、气-液色谱色谱分类o定义o分类11.2 色谱法基础知识11.2.1 色谱过程11.2.2 色谱法基本术语11.2.3 色谱法分类11.3.4 色谱基本类型的分离机理11.2 色谱法基础知识11.2.1色谱过程吸附色谱过程的实质：色谱过程是吸附与解析的过程；不同组分极性的差异导致吸附与解析的差异；不同组分向前移动的过程是差异不断累积过程，是在动态中由量变到质变的过程。BAABBABBABABct流动相

8、样品液色谱柱固定相检测器11.2 色谱法基础知识11.2.3 基本术语测定流出组分的浓度对时间或流动相流出体积的曲线，称为色谱流出曲线、色谱图。图11-2 色谱流出曲线AOAEGFH进样 空气峰C I DJtBh21h.6670h221/WW0tRRtt信号O01. 色谱流出曲线2. 保留值/相对保留值3. 相平衡参数4. 分离参数11.2 色谱法基础知识11.2.3 基本术语基线、峰高、峰宽、峰面积峰宽：标准差、峰宽W、半峰宽W1/2图11-2 色谱流出曲线AOAEGFH进样 空气峰C I DJtBh21h.6670h221/WW0tRRtt信号O02/12/1699. 1354. 24WW

9、WW1. 色谱流出曲线2. 保留值/相对保留值3. 相平衡参数4. 分离参数11.2 色谱法基础知识11.2.3 基本术语保留时间 、死时间 、调整保留时间 ：保留体积 、死体积 、调整保留体积 ：相对保留值(r),也称分离因子保留指数(I)Rt0RR0ttt uLt，RVcR0Rc00FtVVVFtV，12RR1 ,212kkttr)(R)(R)(R)(Rlglglglg100ZnZZxxttttnZI1. 色谱流出曲线2. 保留值/相对保留值3. 相平衡参数4. 分离参数0tRt0VRV11.2 色谱法基础知识11.2.3 基本术语分配系数分配系数：色谱过程中，在流动相和固定相中的溶质分子

10、处于动态平衡。平衡时组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度(c)之比，称为分配系数(K)。msccK K取决于温度、化合物的组成和性质、流动相和固定相的性质；K越大表示组分与固定相作用越强、在色谱柱中移行越慢、保留时间越长；色谱分离的前提条件是组分在两相中的K不同。1. 色谱流出曲线2. 保留值/相对保留值3. 相平衡参数4. 分离参数11.2 色谱法基础知识11.2.3 基本术语容量因子：在平衡状态下，组分在固定相(s)与流动相(m)中的质量之比： )1 (-0000msmmssktttttttkVVKVcVckRRR，k大的组分在柱中滞留的时间长，较迟流出色谱柱；反之则较早流出色谱柱。若

11、两组分能被分离，则它们的迁移速度不同、形成差速迁移，即保留时间不等、保留因子也不等。不同组分实现色谱分离的先决条件是组分的保留因子存在差异。k与组分、固定相和流动相的性质及温度、压力等有关，反映组分与固定相和流动相之间作用力的大小。1. 色谱流出曲线2. 保留值/相对保留值3. 相平衡参数4. 分离参数11.2 色谱法基础知识11.2.3 基本术语分离因子：又称为分配系数比或选择性系数。分离度：相邻两个组分的色谱峰，其保留时间差与两峰峰底宽平均值之比。;1212RRRR121212KKkkVVtt，。12RRs2112WWttR 1. 色谱流出曲线2. 保留值/相对保留值3. 相平衡参数4.

12、分离参数11.2 色谱法基础知识11.2.3 基本术语设色谱峰为正常峰，且W1W2，(W1+W2)/2=4。若Rs=1，峰尖距为4，两峰略有重叠；若Rs=1.5，峰尖距为6，两峰完全分开。一般规定两相邻峰的Rs1.5作为色谱峰达到分离的指标。分离因子仅仅反映两个组分的热力学参数相比较的关系，与色谱动力学参数(如峰宽)无关，不能作为完全分离的指标；分离度是两组分的热力学参数保留时间(差值)与动力学参数峰宽(平均值)的比值，可作为完全分离的指标。1. 色谱流出曲线2. 保留值/相对保留值3. 相平衡参数4. 分离参数11.2 色谱法基础知识11.2.4 色谱基本类型的分离机理以固体吸附剂为固定相，

13、利用被分离组分对固定相表面吸附活性中心吸附能力的差别为实现分离。mXmYmaaX图11-4 吸附色谱示意图X.溶质分子；Y.流动相分子；a. 吸附剂；m.流动相。maamYX YXmmaamaaammaa/ )X(/ )X(XXYXYXVnSnKKnn：，简化o吸附色谱法o分配色谱法o离子交换色谱法o空间排阻色谱法11.2 色谱法基础知识11.2.4 色谱基本类型的分离机理利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。固定相为涂渍在多孔惰性载体上的固定液，流动相可为气体或液体。图11-5分配色谱示意图Xm流动相中游离的组分分子Xs固定相中溶解的组分分子mmssmsms/ )X(/ )

14、X(XXVnVnccKmXsXms根据固定相和流动相的极性相对强度，分为正相分配色谱和反相分配色谱，流动相的极性比固定相弱的称为正相分配色谱，流动相的极性比固定相强的，称为反相分配色谱。o吸附色谱法o分配色谱法o离子交换色谱法o空间排阻色谱法11.2 色谱法基础知识11.2.4 色谱基本类型的分离机理以离子交换作用分离离子型化合物的液相色谱法。利用被分离组分的离子交换能力的差别而实现分离。固定相为离子交换剂，流动相为一定pH和离子强度的缓冲溶液。图7-6离子交换色谱示意图1.固定离子；2.可交换离子R.树脂骨架；m.流动相XRX XRXssKK或m21RRXY RYXRXY RYX：阴离子交换

15、反应阳离子交换反应o吸附色谱法o分配色谱法o离子交换色谱法o空间排阻色谱法阳树脂和阴树脂的失活与再生。11.2 色谱法基础知识11.2.4 色谱基本类型的分离机理空间/分子排阻色谱法(SEC)：以凝胶为固定相。有机溶剂流动相凝胶渗透色谱法；水溶液为流动相凝胶过滤色谱法。利用被分离组分分子大小的不同，在固定相上选择性渗透实现分离。s0RmspVVVccK分子排阻色谱示意图Ge.凝胶；m.流动相Gem大分子大分子应用：药物大分子、生物大分子、合成高分子等。流动相凝胶孔隙o吸附色谱法o分配色谱法o离子交换色谱法o空间排阻色谱法11.3 色谱分离的基本理论11.3.1 影响保留行为的因素11.3.2

16、等温线11.3.3 塔板理论11.3.4 速率理论11.3.5 影响分离度的因素11.3 色谱分离的基本理论11.3.1 影响保留行为的因素推导色谱过程方程：在实验条件一定时，固定相和流动相的选择和体积都是确定的，故tR取决于K，也就是取决于组分的性质，所以保留时间是对组分进行色谱定性的指标。ms0R0Rmsmmss11VVKttkttVVKVcVck：，色谱过程方程保留时间：保留因子：Vs固定相的体积Vm流动相的体积K,tR,组分后出柱K0， 组分不保留K,组分完全保留11.3 色谱分离的基本理论11.3.2 等温线在一定温度条件下，组分在固定相和流动相的分配达到平衡时，在两相中的浓度之比值

17、K为常数，由此绘制出的cs与cm的关系曲线，称为等温线。aK=cs/cmbccscmtRcb前延峰a正常峰c拖尾峰11.3 色谱分离的基本理论11.3.2 等温线对称因子/拖尾因子u完全对：fs=1.00u对称峰：fs=0.951.05u前延峰：fs0.95 (AB)u拖尾峰：fs1.05 (AB)图11-5 对称因子的计算ABAAWfhs2205. 0Wh/2h0.05hW0.05hAB11.3 色谱分离的基本理论11.3.3 塔板理论o色谱柱是由一系列连续、等距的水平塔组成，在柱内每层塔板内部，组分能够在流动相和固定相两相中达到平衡。o流动相通过色谱柱呈间歇式前进运动，每次前进为一个塔板体

18、积。o样品和流动相同时加在第一个塔板上，且样品垂直于前进方向的扩散(即纵向扩散)可以忽略。o分配系数在各塔板上是常数。1. 基本假设2. 计算公式3. 优点和局限11.3 色谱分离的基本理论11.3.3 塔板理论塔板理论的这些假设，实际上是把组分在两相间的连续转移过程，分解为间歇地在单个塔板中的分配平衡过程，经过多次分配平衡后，分配系数小的组分先达到塔顶(即挥发性大的组分先流出色谱柱)。色谱柱的塔板数可高达几千甚至几万，使被测组分在分配系数间有微小的差别时就可以得到分离。1. 基本假设2. 计算公式3. 优点和局限11.3 色谱分离的基本理论11.3.3 塔板理论1. 基本假设2. 计算公式3

19、. 优点和局限1.000 1.000流动相固定相0.333 0.6670.667 0.333 0.333 0.6670.667 0.333 0.222 0.2220.111 0.4450.445 0.1110.222 0.222 0.222 0.2220.111 0.4450.445 0.1110.222 0.222 0.148 0.0740.148 0.2960.037 0.2970.297 0.0370.296 0.1480.074 0.148N=0N=1N=2N=3 0.148 0.0740.148 0.2960.037 0.2970.297 0.0370.296 0.1480.074

20、0.148 0.099 0.0250.148 0.1480.074 0.2960.012 0.1980.198 0.0120.296 0.0740.148 0.1480.025 0.099 0.099 0.0250.148 0.1480.074 0.2960.012 0.1960.198 0.0120.296 0.0740.148 0.1480.025 0.099 0.066 0.0080.132 0.0660.099 0.1970.033 0.2630.004 0.1320.132 0.0040.263 0.0330.197 0.0990.066 0.1320.008 0.066N=4进样分

21、配平衡进气分配平衡KA=2KB=0.511.3 色谱分离的基本理论11.3.3 塔板理论理解：在tR一定时，W(W1/2) 越小，N越大，H越小，色谱柱的分离效率越高。因此，理论塔板数是评价柱效能的指标。；22/1R2R2Reff22/1R2R2Reffeff254. 51654. 516WtWttNWtWttNNLHHLNLH有效理论塔板数：理论塔板数：有效板高理论塔板数理论板高1. 基本假设2. 计算公式3. 优点和局限11.3 色谱分离的基本理论11.3.3 塔板理论优点：塔板理论是半经验性理论，在解释流出曲线的形状、浓度极大点的位置、评价柱效高低等方面是成功的。局限：塔板理论的基本假设

22、与事实不完全相符，它无法解释谱带扩展的原因，也无法解释色谱过程与流动相流速、柱内分子扩散传质过程以及色谱操作参数等动力学因素的关系。这些问题，在速率理论中得到了圆满的解决。1. 基本假设2. 计算公式3. 优点和局限为了克服塔板理论的缺陷，Van Deemter等在Martin等人的工作基础上，比较完整地解释了速率理论。Giddings等又作了进一步的完善。速率理论充分考虑了溶质在两相间的扩散和传质过程，更接近溶质在两相间的实际分配过程。 当溶质谱带向柱出口迁移时，必然会发生谱带展宽。谱带的迁移速率的大小决定于流动相线速度和溶质在固定相中的保留值。同一溶质的不同分子在经过固定相时，它们的迁移速

23、率是不同的，正是这种差异造成了谱带的展宽。谱带展宽的直接后果是影响分离效率、降低检测灵敏度，所以，抑制谱带展宽就成了高效分离追求的目标。 影响塔板高度的动力学因素：涡流扩散、纵向扩散、传质阻力，这些因素都统一于van Deemter方程中。11.3 色谱分离的基本理论11.3.4 速率理论11.3 色谱分离的基本理论11.3.4 速率理论BCAHCuuBAH2最小符号名 称单位H塔板高度塔板高度cmA涡流扩散项涡流扩散项cmB纵向扩散系数纵向扩散系数cm2s-1C传质阻力系数传质阻力系数 s u载气线流速载气线流速cms-1图11-6 范氏方程中各项对板高的贡献0tLu van Deemter

24、方程影响H的动力学因素11.3 色谱分离的基本理论11.3.4 速率理论Van Deemter方程方程中各项的意义符号名称关系式备 注A涡流扩散项(多路径项)A=2dpdp固定相颗粒平均直径；涡流扩散因子，与填充的均匀性有关B/u纵向扩散项(分子扩散项)B=2rDgr 曲折因子，反映固定相颗粒的空间结构。填充柱r0.5-0.7,空心柱r1；Dg 组分分子在载气中的扩散系数Cgu气 相传质阻力项k：容量因子Clu液 相传质阻力项df ：固定液液膜厚度，Cl： 组分在固定液中的扩散系数gpgDkdkC222101. 0()lflDdkkC222+18=van Deemter方程影响H的动力学因素1

25、1.3 色谱分离的基本理论11.3.4 速率理论涡流扩散：引起涡流扩散的原因是色谱柱内的多路径。溶质分子在前进过程中形成的这种紊乱类似于涡流的流动，所以称之为涡流扩散。A=2dp 。 空心毛细管柱无多径相：A=0 ABC柱管壁 固定相 组分移行轨迹初始带宽谱带展宽流动相方向van Deemter方程影响H的动力学因素11.3 色谱分离的基本理论11.3.4 速率理论分子扩散(纵向扩散)：是溶质分子在移动方向上向前和向后的扩散，引起谱带展宽，原因是浓度梯度。分子扩散引起的峰展宽由下式决定：uDuB/2/go式中B为纵向扩散系数；为弯曲因子，填充柱=0.5-0.7，毛细管=1；Dg为溶质在流动相中的扩散系数；u 为流动相线速度。van Deemter方程影响H的动力学因素分子扩散引起的色谱峰展宽示意图11.3 色谱分离的基本理论11.3.4 速率理论传质阻力(C) ，是溶质在固定相中传质阻力系数与流动相(气相)传质阻力系数之和：CClCg流动相传质阻力引起的扩散(Cl)溶质分子要从流动相转移到固定相中，就要从流动相主体扩散到气-液、气-固、液-