院感细菌培养操作

1、精品文档1. 目的 : 医院是病原微生物较集中 , 抵抗力低的人群密集的地方 , 加之化疗、放疗等手段的采用，影响病人免疫机能下降，大量使用抗生素，引起耐药菌株增多，菌群失调，以及先进医疗仪器广泛应用等原因， 增加消毒灭菌的难度， 致使院内感染已成为当前医疗实践的严重障碍， 直接影响医疗效果。进一步规范院内感染监测标本的程序，更好、更快检测病原微生物的生长情况，预防医院感染的发生。2. 设备、试剂与材料2.1VITEK 2 compact 鉴定药敏分析系统2.2VITEK 32 鉴定药敏分析系统2.3美国 FORMA级生物安全柜2.4显微镜2.5酒精灯2.6接种环2.7恒温培养箱2.8各种培养

2、基2.9革兰氏染色液2.10触酶试剂2.11氧化酶试剂2.12移液器2.13无菌吸嘴3. 院感标本采集3 1 空气的采样3 1 1 采样时间选择消毒处理后与进行医疗活动之前期间采样。3 1 2 采样高度与地面垂直高度80-150CM。3 1 3 布点方法室内面积 30m2，设一条对角线上取三点，即中心一点，两端各距墙1m2处各取一点；室内面积30m，设东、西、南、北、中5 点，其中东、西、南、北点均距墙1m。3 1 4 采样方法用 9cm 直径普通营养琼脂平板在采样点暴露5min 后送检。3 2 物体表面采样3 2 1 采样时间选择消毒处理后4 小时内进行采样。3 2 2 采样面积222被采表

3、面 100cm ，取全部表面；被采表面100cm，则取100cm。3 2 3 采样方法用 5× 5 cm2 的标准来灭菌规格板，放在被检物体表面，用无菌规格板，放在被检物体表面， 用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子1 支，在规格板内横竖往返各涂抹5 次，并随之转动棉拭子，连续采样1-4 个规格板面积，剪支手接触部位，将棉拭子放入装10ml 采样液的试管中送检。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体的方法采样。3 3 医护人员手采样.精品文档3 3 1 采样时间在接触病人、从事医疗活动前进行采样。332 采样面积及方法被检人五指并拢，将浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子一枝在双2手指曲面从

4、指跟到指端来回涂擦各两次（一只手涂擦面积 30 cm），并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位， 将棉拭子放入装有 10ml 采样液的试管内送检。 采样面积按平方厘米 （ cm2）计算。3 4 医疗用品采样3 4 1 采样时间在消毒或灭菌处理后，存放有效期内采样。342 采样方法右用破坏性方法取样的医疗用品，如输液（血）器、 注射器和注射针等，取其中的一部分放培养液中培养。对不能用破坏性方法取样的特殊医疗用品，可用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子在被检物体表面涂抹采样，被采表面100cm2，取全部表面；被采22表面 100cm，取 100cm。3 5 使用中消毒剂的采集3 5 1 采样时间采取使用

5、中的消毒剂。3 5 2 采样方法在无菌条件下，用无菌注射器抽取1ml 被检样品，加入10ml 稀释液混匀。（对于醇类与酚类消毒剂稀释液用灭菌生长盐水；对于含氯消毒剂、含碘消毒剂、过氧化物消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入0.1%硫代硫酸钠；对于洗必泰、季铵盐类消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入3%（ w/v）吐温 80 和 0.3%卵磷脂；对于醛类消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入0.3%甘氨酸；对于含有表面活性剂的各种消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入3%（ w/v ）吐温 80，以中和被检样液的残效作用。）3 6 内镜的采样3 6 1 咽喉镜、支纤镜用 10ml 戊二醛中和液冲洗内镜后，送检实验室。3 6

6、 2 胃镜、消化镜、宫腔镜用 10ml0.1%硫代硫酸钠中和液冲洗内镜后，送检实验室。3 6 3 鼻咽镜、过氧化氢消毒的腔镜类用 10ml 生理盐水中和液冲洗内镜后，送检实验室。3 7 透析液的采样用灭菌的空试管取透析液10ml 送检。4. 院感标本的运送及交接签收4 1 标本的采集4 11 空气标本的采集由临床科室负责完成，标本采集完毕，由临床各科在规定的时间内将标本安全送回实验室。4 12 物体表面、医务人员手、消毒剂、内镜等由院感科负责组织采样，在规定时间内将标本安全送达实验室。4 2 采样后必须尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不得超过6 小时，若样品保存于 0-4 条件时，送检时

7、间不得超过24 小时。4 3 标本收回实验室后, 将标本的信息登记在“院感监测登记本”上。4 4 微生物室工作人员的验收根据微生物室院感标本拒收标准进行检查，对不符合要求.精品文档的，将拒收，立即退回给送检人员，指出问题，告知标本重取，所有拒收标本均需在标本拒收记录本上登记。拒收情况如下：4 4 1 空气培养平板数目击者不正确（房间小于30 平方米做3 个平板培养，房间大于30平方米做5 个平板培养） 。4 4 2 未注明标本采集科别、来源和培养目的。4 4 3 标本明显受污染。5.检测步骤见本文件末面流程图5 1 空气标本的检测511 细菌室收到标本后，将标本编写当日日期，用平板压住验单，直

8、接放入35培养箱培养 48 小时后，观察结果。5 12 有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，排除金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、铜绿假单胞菌等致病微生物的检出。5 1 3 结果计算及菌落换算空气细菌菌落总数（cfu/m 3） =50000N/AT，式中A平板面积， cm2；T平板暴露时间，min；N平均菌落数，cfu/ 平皿。即平皿上1 个菌落等于空气中菌落数为157 cfu/m 3 ，如果标本为3 个点时换算 =平皿上的菌落数×157÷点数。5 2 物体表面样本检测5 2 1 细菌室收到标本后，将标本编号，振摇80 次后，吸500ul 于普通琼脂平板中，把平板摇均匀，放入35培

9、养箱培养48 小时后，观察结果。5 22 有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，排除金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、铜绿假单胞菌等致病微生物的检出，如为儿科、爱婴区、新生儿科、儿科ICU 的标本时，还要排除沙门氏菌的检出。523 结果计算及菌落换算物体表面细菌菌落总数（ cfu/c2m）=平皿上菌落数×采样液稀释倍数 （ A）/ 采样面积 （cm2）。采样液稀释倍数即是采集液总量与接种的采集液量之比值，即平皿上 1 个菌落等到于物体表面上菌落数为0.2cfu/cm 2。5 3 医护人员手样本检测5 3 1 将标本编号，振摇80 次后，吸 500ul于普通琼脂平板中，如为儿科、爱婴区、新生儿科

10、、儿科ICU 的标本时，加做一个HE平板，以监测沙门氏菌的检出。把平板摇均匀，放入 35培养箱培养48 小时后，观察结果。5 32 有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，排除金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、铜绿假单胞菌等致病微生物的检出。533 结果计算及菌落换算手细菌菌落总数（cfu/cm2）=平皿上菌落数×采样液稀释倍数（ A） /30 × 2（ cm2），即平皿上1 个菌落等到于物体表面上菌落数为0.33cfu/cm2。5 4 灭菌或一次性医疗用品样本检测541 样本采集完成后，接种于肉汤培养基，置35培养箱培养7 天，每天观察一次，培养基有混浊则转种普通平板继续培养，观察最

11、后结果。.精品文档5 4 2 有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，结果报告是否检出细菌。5 5 使用中消毒剂5 5 1 细菌室收到标本后，将标本编号，振摇80 次后，吸500ul 于普通琼脂平板中，如为儿科、爱婴区、新生儿科、儿科ICU的标本时，加做一个HE平板，以监测沙门氏菌的检出。把平板摇均匀，放入35培养箱培养48 小时后，观察结果。另接种于1 个沙保劳培养基，置28培养箱培养7 天，每天观察一次，观察最后结果。5 5 2 有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，结果报告是否检出细菌及真菌。5 5 3 结果计算及菌落换算使用中消毒剂细菌菌落总数（cfu/ ml） =平皿上菌落平均数×采

12、样液稀释倍数 （ A）/ 采样体积（ 1ml），即平皿上1 个菌落等于消毒剂中菌落数为10 cfu/ml。5 6 灭菌效果监测561 压力蒸汽灭菌效果监测采用嗜热脂肪芽胞杆菌菌片，放于溴甲酚紫蛋白胨水指示剂中，标本送检后，把里面的玻璃压碎，置于56培养箱培养48 小时，如指示剂颜色为紫色，说明无嗜热脂肪芽胞杆菌生长；如指示剂颜色为黄色则说明有嗜热脂肪芽胞杆菌生长。5 62 气体灭菌效果监测采用枯草芽胞杆菌菌片，放于溴甲酚紫蛋白胨水指示剂中，标本送检后， 置于 35培养箱培养48 小时，如指示剂颜色为紫色，说明无枯草芽胞杆菌生长；如指示剂颜色为黄色则说明有芽枯草胞杆菌生长。5 7 内镜标本检测5

13、 7 1 将标本编号，用旋涡器充分震荡（振摇80 次），取 0.5ml ，加入直径9CM的普通琼脂平板上，把平板摇均匀，放入35培养箱培养48 小时后计数，观察结果。5 72 有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，排除金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、铜绿假单胞菌等致病微生物的检出。5 7 3 结果计算及菌落换算细菌菌落数 / 镜 =平皿菌落数× 205 8 透析液样本检测581 将标本编号， 振摇 80 次后，吸 200ul 于普通琼脂平板中，反平板摇均匀， 放入 35培养箱培养48 小时，观察结果。5 8 2 有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，排除金黄色葡萄球菌，、溶血链球菌、铜绿假单胞菌

14、等致病微生物的检出。5 8 3 结果计算：透析液细菌菌落总数=平皿菌落数×56. 质量控制6 1 做好培养基及样本采集液的质量控制，确保其无菌以及适宜于细菌的生长。6 2 标本采集严格按照采集要求进行。6 3 做好培养箱的温度控制。7. 各类环境空气、物体表面、医护人员手细菌菌落总数卫生标准，见下表标准.精品文档类别范围空气物体表面医护人员手cfu/m 3cfu/cm 2cfu/cm 2类层流洁净手术室、层流洁净病房 10 5 5类普通病房、产房、婴儿室、早产儿 200 5 5室、普通保护性隔离室、供应室无菌室、烧伤病房、重症监护病房类儿科病房、 妇产科检查室、 注射室、 500 1

15、0 10换药室、治疗室、供应室清洁室、急诊室、化验室、各类普通病房和房间类传染病科及病房- 15 1572 致病性微生物不得检出金黄色葡萄球菌，、溶血链球菌及其他致病性微生物。在可疑污染情况下进行相应指标的检测，母婴同室、早产儿室、婴儿室、新生儿及儿科病房的物体表面和医护人员手上，不得检出沙门氏菌。7 3 医疗用品卫生标准7 3 1 进入人体无菌组织、器官或接触破损皮肤、粘膜的医疗用品必须无菌。732 接触粘膜的医疗用品细菌菌落总数应20cfu/g或 100 cm2，致病性微生物不得检出。733接触皮肤的医疗用品细菌菌落总数应200cfu/g或 100 cm2，致病性微生物不得检出。7 4使用

16、中消毒剂卫生标准使用中消毒剂：细菌菌落总数应100 cfu/ml ；致病性微生物不得检出。7 5内镜消毒后的卫生标准细菌菌落总数应20cfu/ 件；致病性微生物不得检出。7 6透析液消毒后的卫生标准761入水口细菌菌落总数应 200cfu/ml；致病性微生物不得检出。762出水口细菌菌落总数2000cfu/ml；致病性微生物不得检出。8. 院感标本报告的录入8 1 在电脑点击“院感系统”，进入“院内检测” ，在“环境卫生学及消毒灭菌效果监测结果”中根据检测的结果输入相关的项目。输入抽检科别、标本类别、抽检项目、报告结果/细菌总数、标本单位、检出细菌、送检日期、报告日期、检验者、院感受办抽查、次

17、数。结果输完后按保存键，审核无误后按审核键。按录入键继续下一标本的录入。录入完毕退出系统。8 2 阴性院内感染监测标本的报告方式8 21 空气、物体表面、消毒液、灭菌生物监测菌片培养结果阴性发报告为“无菌生长”。8 2 2 无菌物品培养结果阴性发报告为“无细菌生长”。.精品文档8 3 阳性院内感染监测标本的报告方式8 3 1 空气培养结果阳性发报告为“ XX cfu/m 3”。832物体表面培养结果阳性发报告为“XX cfu/cm 2”。833消毒液培养结果阳性发报告为“XX cfu/ml ”。834生物监测菌片培养结果阳性发报告为“检出枯草芽胞杆菌/ 嗜热脂肪芽胞杆菌” 。835无菌物品阳性发报告为“检出细菌” 。9. 参考文献1中华人民共和国卫生部，制定，医院感染管理文件汇编，附录A：采样及检查方法。2任南，主编， 实用医院感染监测方法与技术，湖南，湖南科学技术出版社，2008.3.精品文档院感标本处理流程图手、台面、物表震荡标本约20 秒，吸 500ul 到普通平板上置 35培养箱培养48 小时后看结果消毒液培养震荡标本约20 秒，吸 50