微生物表面擦拭方法验证方案

1、精选优质文档-倾情为你奉上微生物棉签擦拭取样方法及检验方法验证方案文件编号：VP-01-06-00-037起草人_ 日期_审核人_ 日期_批准人_ 日期_ 1、概述微生物在适当的温湿度下以残留物中的有机物为营养可大量繁殖， 产生各种代谢物，从而大大增加残留物的复杂性和危害程度，对下批产品造成污染。 因此必须对药品生产设备的微生物进行严格控制。制药企业的生产场所、设备、用具等在生产结束后需清洁，根据GMP的要求，清洁后应对清洁效果进行评价，设备表面微生物限度检查应符合要求，擦拭取样优点是能对最难清洁部位直接取样，通过考察有代表性的最难清洁部位的表面微生物限度评价设备的清洁状况。对棉签擦拭取样方法

2、和检验方法的可行性进行验证，确保清洁方法的有效性，降低药品交叉污染和微生物污染的风险。2、验证依据：中华人民共和国药典2015版 四部3、验证目的通过对清洗消毒后微生物取样方法的回收率试验，评价取样方法的有效性、代表性和科学性，并为证明清洗方法有效性提供基本依据。4 、范围 本次验证适合微生物棉签擦拭法取样。5、验证小组成员及职责 表1 验证小组成员及职责人 员姓 名职 位职责组 长吴涛QC负责人负责验证方案和报告的审核及实施过程监督。成 员彭雪梅QA负责验证过程的监控和检查，保证验证方案的实施谭裴QC1、负责验证方案及报告的起草2、负责检验操作，数据的收集、记录的填写李树冰QC协助验证方案及

3、报告的起草，负责对验证数据的复核。6、验证风险评估及范围6.1根据验证管理规程对验证的相关要求，对检测过程中可能影响检测结果的因素进行风险分析。风险定性标准如下：6.1.1严重性（S）： 危害可能产生后果的程度。严重程度分为十个等级，如下：权重严重性等级在产品质量或法规方面可能导致的后果对产品造成的后果10极高可能会导致药监部门吊销药品生产许可证或撤销GMP证书可能会导致检测结果不准确或不可靠。9非常高8很高可能会产生不符合GMP的关键缺陷，或者导致上市药品召回7高6中等可能会产生不符合GMP、SOP的重要缺陷可能导致检测结果产生重大偏差，对产品质量有较大影响5低可能会产生不符合GMP、SOP

4、的一般缺陷可能导致检测结果产生偏差，对产品质量有一定影响4很低可能会产生不符合GMP、SOP的一般缺陷可能导致检测结果产生偏差，但在可接受范围3轻微2很轻微不违反GMP、SOP的轻微缺陷对检测结果无影响或影响可以忽略1无6.1.2可能性（P）：影响检测结果的事件发生的可能性频率或概率，建立以下等级：权重发生的可能性等级确认标准可能的失效率10很高几乎是不可避免的。1/291/38高时有发生，且为主要因素。1/871/206中等时有发生，但不是主要因素。1/8051/40041/20003低相似的情况很少发生。1/150002很低完全相同的情况很少发生。1/1极低异常情况不大可能发生，几乎完全相

5、同的异常情况也未发生过。1/6.1.3.可检测性（D）： 检测到异常情况存在的能力的程度，定义如下：权重可检测性等级确认标准10几乎不可能没有已知的控制方法能找出异常情况。9很微小现行控制方法找出异常情况的可能性很微小。8微小现行控制方法找出异常情况的可能性微小。7很小现行控制方法找出异常情况的可能性很小。6小现行控制方法找出异常情况的可能性小。5中等现行控制方法找出异常情况的可能性中等。4中上现行控制方法找出异常情况的可能性中等偏上。3高现行控制方法找出异常情况的可能性高。2很高现行控制方法找出异常情况的可能性很高。1几乎肯定现行控制方法几乎肯定能找出异常情况。6.2风险优先数量等级判定（R

6、PN） 6.2.1风险等级判定标准的确定等级低风险上限(不包括)高风险下限(包括)严重性轻微：对产品质量的影响：可能导致检测结果产生偏差，但在可接受范围。(分值：3分)低：对产品质量对影响：可能会导致检测结果不准确或不可靠，直接影响产品质量。(分值：5分)等级低风险上限(不包括)高风险下限(包括)可能性低：很少几次与相似的情况发生。(分值：3分)偶尔发生的失败。(分值：5分)可检测性高：现行控制方法找出异常情况的可能性高。(分值：3分)中等：现行控制方法找出异常情况的可能性中等。(分值：5分)RPN3×3×3=275×5×5=1256.2.2风险等级判定

7、标准判定公式（测量范围1-10）RPN风险等级是否可接受是否须采取措施RPN=S×P×D1RPN27低是否27RPN125中否提高可检测性及或降低风险产生的可能性来降低最终风险水平125RPN1000高否注：当1RPN27，但严重性S×发生可能性P为10×2或9×2时，仍需按中等以上风险进行后续控制。专心-专注-专业6.3.风险评估过程6.3.1风险识别采用5M1E分析法从人、机、料、法、环等方面进行分析：方法验证异常料人机对照培养基、检查用培养基、检定菌培养箱，净化工作台 棉签验证方案编写人员电子天平，pH计，灭菌器缓冲液、消毒剂、纯化水无菌

8、器具、无菌手套/衣服试验人员实验组菌种回收率不达标样品储存环境培养基、缓冲液、无菌器具、消毒剂的制备方法验证方法不正确 培养环境及观察环境 洁净区环境（供试品溶液检查环境）测环 法6.3.2 阿莫西林胶囊微生物限度检查方法验证风险分析：序号项目潜在的失效模式潜在的失效后果严重性S潜在失效造成原因发生可能性P现有控制措施可检测性DRPN措施结果采取措施SPDRPN01验证方案编写人员编写人员未按照分析方法验证管理制度规定编写验证方案。验证方法错误，导致实验结果不可靠。8人员培训考评不到位。2严格按照分析方法验证管理制度规定编写验证方案116对验证方案编写人员进行培训和考评，合格后方可进行验证方案

9、的编写工作。811802试验人员试验人员未按照编写验证方案进行操作。操作不正确，导致实验结果不可靠。8试验人员培训不到位。2对实验人员进行验证方案培训116检测前培训验证方案，试验严格按验证方案实施。811803培养箱，净化工作台仪器没有经过计量、确认，或不在计量、确认效期内。导致检测环境和培养环境不符合要求，最终导致验证试验失败。6使用人员使用前未对使用的设备进行校准日期进行检查。2编写验证方案前检查所使用仪器的校准日期112设备使用人员使用前对设备的计量效期、确认效期进行确认，在效期内方可使用。611604电子天平，pH计，灭菌器仪器没有经过计量、确认，或不在计量、确认效期内。导致实验结果

10、出现异常。8使用人员使用前未对使用的设备进行检查确认。2编写验证方案前检查所使用仪器的校准日期116设备使用人员使用前对设备的计量效期、确认效期进行确认。在效期内方可使用。811805对照培养基、检查用培养基、检定菌对照培养基、检查用培养基、检定菌失效。导致验证失败。6未对照培养基、检查用培养基、检定菌、进行期间核查。使用前未对效期进行检查确认。2对照培养基、检查用培养基、检定菌、进行期间核查。使用前对效期进行检查确认。112对耗材管理人员进行培训，严格执行培养基管理制度”和检定菌及菌液管理规程”规定的核查周期。试验人员使用前对有效期进行检查确认，合格后方可投入使用。8118序号项目潜在的失效

11、模式潜在的失效后果严重性S潜在失效造成原因发生可能性P现有控制措施可检测性DRPN措施结果采取措施SPDRPN棉签被污染导致验证失败6棉签未灭菌2使用前对棉签灭菌112使用前对棉签灭菌情况确认无误后方可投入使用611606缓冲液、消毒剂、纯化水缓冲液、消毒剂、纯化水配制不正确或过有效期或性状明显异常。导致验证失败。6未严格按照标准要求制备缓冲液和消毒剂；使用前未进行效期和性状确认。2对实验人员进行验证方案培训112对缓冲液、消毒剂、纯化水的管理人员进行培训，抽查期间效期。811807无菌器具、无菌手套/衣服无菌器具、无菌手套/衣服，超过有效期。导致验证失败。61.未严格按照微生物实验室管理制度

12、对无菌器具、无菌手套/衣服进行灭菌。2.使用前未确认无菌器具、无菌手套/衣服进行效期、包装确认。2使用前对无菌器具、无菌手套/衣服灭菌、对有效期及包装的完整性进行检查。1121严格按照微生物实验室管理制度对无菌器具、无菌手套/衣服灭菌。2.使用前对无菌器具、无菌手套/衣服的有效期及包装的完整性进行确认。无误后方可投入使用611608擦拭取样操作不正确。导致验证失败。8培训不到位。1对实验人员进行擦拭取样培训。18对实验人员进行擦拭取样培训。8118序号项目潜在的失效模式潜在的失效后果严重性S潜在失效造成原因发生可能性P现有控制措施可检测性DRPN措施结果采取措施SPDRPN09验证方法不正确1

13、.验证方案编写不正确。2.未严格按照验证方案开展验证工作。导致验证失败。8检测方案未经批准。1对验证方案进行审核181.验证方案审核批准后方可开展确验证工作。2.验证方案培训后方可实施。811810实验组菌种回收率不达标各实验组菌落回收率高于或低于标准范围。导致验证失败。10试验人员计数错误。2结果观察时实施复核制度。120对实验室人员进行培训，结果观察时实施复核制度。10111011样品储存环境样品储存环境温度、湿度异常。不符合样品规定的存放环境。导致样品被污染或失效。7样品存放环境温湿度控制不当。2严格控制样品存放环境温湿度114每天定期观察样品存放室的温湿度，若异常，及时采取措施调整。7

14、11712培养环境及观察环境培养箱培养环境温湿度和观察环境异常。培养计数结果不准确，导致验证失败。7培养箱温湿度控制不准确及观察方法不正确。2每日定期观察培养箱温湿度1141.每天定期观察培养箱的温度，若异常，及时采取措施。2.对观察方法进行培训。711713洁净区环境1.洁净区温湿度、压差异常。2.洁净区环境被污染。影响验证结果。71.检测环境温湿度、压差控制不当。2.未定期对洁净区进行清洁和消毒。3.未定期监测的环境。2每天定期观察洁净区温湿度、压差1141.每天定期观察洁净区温湿度、压差，若异常，及时采取措施调整。2.按照SOP规定定期对洁净区环境进行清洁和消毒；3.定期对微生物检测室环

15、境进行监测并出具报告。71176.4表面微生物擦拭取样限度检查方法验证的不可接受风险汇总：编号项目/功能RPN（S×P×D）风险等级01实验组菌种回收率不达标20（10×2×1）中注：当1RPN27，但严重性S×发生可能性P为10×2或9×2时，仍需按中等以上风险进行后续控制。7、验证实施计划7.1确认前培训方案批准后1个工作日完成验证方案培训。7.2.组织实施确认方案批准后15个工作日内完成验证方案的实施工作。7.3出具报告 验证方案实施完成后5个工作日出具报告。8、 验证前的准备8.1主要验证用仪器仪表的确认8.1.1确

16、认方法：查看手提式压力蒸汽灭菌锅、生化培养箱、霉菌培养箱、电热恒温干燥箱、生物安全柜校验日期，确定是否在有效期内；8.1.2可接受标准：确认提式压力蒸汽灭菌锅、生化培养箱、霉菌培养箱、电热恒温干燥箱、生物安全柜已经过校验，校验合格。8.1.3设备检定情况确认结果 表2 设备检定确认表仪器名称规格型号检定情况检定部门手提式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-18SIAA生化培养箱SHP-250霉菌培养箱BMJ-250电热恒温干燥箱DHG-9141A生物安全柜BHC-800-A2结论检查人/日期复核人/日期8.2试验环境确认8.2.1确认方法：查看阳性对照室、生物安全柜的环境监测报告，确认悬浮粒子、风速、

17、沉降菌、浮游菌、表面微生物是否符合GMP要求。8.2.2可接受标准：确认悬浮粒子、风速、沉降菌、浮游菌、表面微生物符合GMP要求。8.2.3试验环境确认结果 表3试验环境的确认项 目风速悬浮粒子沉降菌浮游菌表面微生物阳性检测室生物安全柜结论检查人/日期复核人/日期8.3验证用菌种及培养基 表4菌种确认菌种名称编号来 源购进日期大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉结论检查人/日期复核人/日期 表5 培养基确认培养基、缓冲液名称干粉批号配制批号干粉来源胰酪大豆胨琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基检查人/日期复核人/日期8.4.人员培训 验证操作人员应在验证实施前应对其批准的验证方案进行

18、培训，确保验证人员能依照验证方案正确实施。培训时间培训人参加培训人员溯源资料确认人/日期复核人/日期9、 验证项目和验证方法9.1试验菌株表面微生物擦拭取样方法及检验方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉。试验菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。9.2 试验菌悬液的制备 9.2.1接种金黄色葡萄球菌、 大肠埃希菌、 枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨琼脂培养基中，于 30 35 培养 18 24 h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡糖糖琼脂培养基中， 于 20 25 培养 48 72h， 上述培养

19、物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1 mL 含菌数 50 100 cfu的菌悬液；9.2.2 接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡糖糖琼脂培养基上，20 25 培养 5 7 d， 加入 3 5 mL 0.9无菌氯化钠溶液， 将孢子洗脱， 然后用管口带有无菌棉花的无菌毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用 0.9无菌氯化钠溶液制成每 1 mL 含菌数 （ 孢子数） 50100cfu 的菌（ 孢子） 悬液。9.2.3 上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时之内使用。9.3擦拭取样法的验证 9.3.1 供试组制备 9.3.1.1取 50mm×50mm不锈钢材质的无菌擦片， 用已校验的 1 mL

20、 移液管吸取检定菌悬液 1 mL， 均匀涂布于无菌擦片上， 并于层流台下吹干， 取无菌棉签 1 支， 用无菌的 0.9%氯化钠溶液浸湿，并将其靠在锥形瓶口上挤压至无多余的浸润剂滴落。 握住棉签柄， 在取样点处选择约为 25 cm2以 30°角与取样表面接触， 纵向缓慢并充分擦拭，反转棉签， 同法横向擦拭（ 见图 1）， 然后将棉签端用无菌剪刀剪断置于 20 mL 的 0.9%无菌氯化钠溶液中，充分振摇 5 min，做好标识，作为供试品溶液。每种菌平行制备两个染菌不锈钢载片。9.3.1.2取全部供试品溶液，经薄膜法过滤后，用pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 50 mL 冲洗滤膜，将滤膜

21、取出，菌面朝上分别贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿及沙氏葡糖糖琼脂培养基平皿上，分别于 3035 培养 72 h、2025培养120 h， 记录各平皿上菌落数。 图 1 擦拭示意图 9.3.2 菌液组制备 吸取菌悬液 1 mL， 加入 0.9%无菌氯化钠溶液20 mL 中， 全部经薄膜过滤法过滤， 用 pPH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液 50 mL 冲洗滤膜， 将滤膜取出，菌面朝上分别贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿及沙氏葡糖糖琼脂培养基平皿上，平行制备2个平皿，分别于 3035 培养 72 h、2025 培养120 h， 记录各平皿上菌落数。 9.3.3 阴性对照组制备 取 0.9%无菌氯化钠溶液

22、20 mL 代替供试品溶液，其它操作同 9.3.1.2。 9.3.4回收率计算回收率以 3 次实验测试值的平均值计。 9.3.5可接受标准回收率70% ，RSD20%。9.3.6擦拭取样法验证实验结果（见附件1）。9.4 微生物限度检验方法学验证 9.4.1 供试组制备 取 50mm×50mm不锈钢材质的无菌擦片，取无菌棉签 1 支，用无菌的 0.9%氯化钠溶液浸湿，并将其靠在锥形瓶口上挤压至无多余的浸润剂滴落。 握住棉签柄， 在取样点处选择约为 25 cm2以 30°角与取样表面接触， 纵向缓慢并充分擦拭，反转棉签， 同法横向擦拭（ 见图 1）， 然后将棉签端用无菌剪刀剪

23、断置于 20 mL 的 0.9%无菌氯化钠溶液中，充分振摇 5 min，做好标识，作为供试品溶液。平行制备两个不锈钢载片。 取供试液 20 mL，菌悬液 1 mL 经薄膜过滤法过滤，用pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 50 mL 冲洗滤膜， 将滤膜取出，菌面朝上分别贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿及沙氏葡糖糖琼脂培养基平皿上，分别于 3035 培养 72 h、2025培养120 h， 记录各平皿上菌落数。9.4.2菌液组制备 取 pH=7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液 100 mL 加入薄膜过滤器中，过滤。 取缓冲液 20 mL， 菌悬液 1 mL 经薄膜过滤法过滤，用pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 50 mL 冲洗滤膜， 将滤膜取出， 菌面朝上分别贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿及沙氏葡糖糖琼脂培养基平皿上，平行制备2个平皿，分别于 3035 培养 72 h、2025培养120 h， 记录各平皿上菌落数。9.4.3 阴性对照组制备 取 0.9%无菌氯化钠溶液 20 mL，经薄膜过滤法过滤， 将滤膜取出，菌面朝上分别贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿及沙氏葡糖