质粒载体的概况及构建

1、质粒载体的概况及制备 质粒的定义、命名1质粒的基本特性2 质粒的分类3 质粒载体的概况 （一）（一） 质粒的定义、命名质粒的定义、命名质粒的定义、命名： 定义：质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。 命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发明者，后面接实验编号。 质粒不是细菌生长所必须的 可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力 分子量在1200kb之间 质粒（plasmid）特点： 能在宿主细胞内独立复制；带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞一些遗传性状。(1) 自主复制性自主复制性（二）质粒的基本特性（二）质粒的基本特性质粒质粒DNA携带有自

2、己的携带有自己的复制起始区复制起始区（ori）控制质粒拷贝数的基因控制质粒拷贝数的基因能独立于宿主细胞的染色体能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制而自主复制同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相容同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相容不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存（2 2）不相容性）不相容性 （3）可扩增性）可扩增性 质粒能自主地进行复制，这样它才能随着细菌细胞的分裂而稳定地遗传。 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复制。 松弛型复制：拷贝数高，一个细胞中可达上千个拷贝； 严谨型复制：拷贝数低，一个细胞中一般低于5个拷贝（1个几

3、个）。（4）可转移性）可转移性 在天然条件下，大多数质粒可通过细菌接合作用从一在天然条件下，大多数质粒可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另一种宿主内。（例如：通过大肠杆种宿主细胞内转移到另一种宿主内。（例如：通过大肠杆菌接合）菌接合） （三）质粒的分类（三）质粒的分类 人工构建的质粒载体分类人工构建的质粒载体分类： 高拷贝数的质粒载体 低拷贝数的质粒载体 失控的质粒载体 插入失活型克隆载体 正选择的质粒载体 质粒的分类质粒的制备实验室一般使用两种方法制备质粒：实验室一般使用两种方法制备质粒： （一）碱裂解法（一）碱裂解法 （二）沸水浴法（二）沸水浴法 （1）碱裂解法原理：利用溶菌酶在Na

4、OH与SDS的混合溶液中破坏细菌外壁，去除染色体DNA及变性蛋白质，离心，苯酚氯仿溶液处理，乙醇或异丙醇沉淀水相质粒。特点：质粒较纯，收获率高，繁琐且有开环现象（2）沸水浴法特点：质粒不纯，收获率低，制备规模小但快速，特别适用于重组质粒的鉴定。 用限制性内切酶消化用限制性内切酶消化DNA样品样品 用限制性内切酶消化质粒用限制性内切酶消化质粒DNA 连接样品连接样品DNA和质粒和质粒DNA的消化产物的消化产物 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞时用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞时转化细菌转化细菌有两个基本方法：有两个基本方法： 一是化学法，即用CaCl 处理并加热激以促进DNA进入菌体； 二是电激法，即施加短脉冲的电荷以促进DNA吸收。 筛选时会有三种结果：筛选时会有三种结果：一是要插