凝胶电泳分离技术

1、 复杂体系的分离技术凝胶电泳分离技术徐正凤（）凝胶电泳分离技术摘要：凝胶电泳（Gel electrophoresis），也可称为胶体电泳或扁平式电泳法。凝胶电泳分离技术用途非常广泛，尤其是在生物学和化学的领域，是用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子的技术，一般可用于质谱、聚合酶链式反应、克隆、DNA测序或者免疫印迹检测之前来进行部分提纯分子。本文将通过对凝胶电泳分离技术的概念，原理，特点和应用四部分的简要介绍，使读者对该技术有一定初步的了解。第一部分 基本概念一、凝胶凝胶（gelatum）又称冻胶，是指溶胶或溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接，形成空间网状结构，结构空

2、隙中充满了作为分散介质的液体或气体，这样一种特殊的分散体系称作凝胶。IUPAC给出的凝胶定义是非流动性的胶态网络或者是贯穿其整个体积由流体膨胀聚合物网络。 （凝胶）凝胶是一种充分稀释的交联系统，在稳定状态下没有流动性。凝胶的主要成分是液体，但由于液体中的三维交联网络，凝胶在很多方面有着与固体相近的特性。凝胶可以包含共价聚合物网络结构，氢键、结晶、螺旋结构，玻璃状结构，层状结构和微粒无序结构。凝胶可分为弹性凝胶和脆性凝胶，弹性凝胶失去分散介质后，体积显著缩小，而当重新吸收分散介质时，体积又重新膨胀，例如明胶等；脆性凝胶失去或重新吸收分散介质时，形状和体积都不改变，例如硅胶等。由溶液或溶胶形成凝胶

3、的过程称为胶凝作用。在凝胶电泳分离技术中，凝胶作为分离分子的基质，在分离蛋白质或小的核酸（DNA、RNA、或寡核苷酸）的时候，通常是用不同浓度的丙烯酰胺和一个交联剂聚合而成，形成不同大小网眼的聚丙烯酰胺网状系统，最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。二、 电泳电泳（electrophoresis）是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。原则上按电泳的原理来分，可分为二类：（1）自由界面电泳，又称移动界面电泳， （电泳原理示意图）是指在没有支持介质的溶液中进行

4、的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。（2）区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。按支持介质种类的不同，区带电泳可分为纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。在凝胶电泳分离技术中，电泳是指在凝胶上用来推动或拉住分子的电动势。三、 凝胶电泳凝胶电泳分离技术（Gel electrophoresis separation technique）是一种以具有网状多孔结构的凝胶为支持物的

5、电泳技术。同时由于凝胶电泳具有电泳和分子筛的双重作用，因此有很高的分离能力。从凝胶层面上来看，有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，从电场层面上来看，有普通电场凝胶电泳和脉冲电场凝胶电泳。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，是我们人类对技术的综合利用，自然成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段。第二部分 基本原理将一种分子放置在电场当中时，它会以一定的速度移向适当的电极，如果分子带负电多就会往氧化极移动，带正电多就往还原极移动。电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。由于在凝胶电泳分离技术中使用了一种无反应活性的稳定

6、的支持介质，如琼脂糖凝胶和V：泳动速度cm/秒或分 u：泳动率或泳动度（cm/伏.秒或分）U：电压 常压（100-500v）高压（500-1000v）仅需几分钟t:电泳时间（秒或分） d:泳动距离cm E:电场强度 v/cm l:支持场的有效长度cm聚丙烯酰胺胶等，从而降低了扩散和对流运动，因此电泳的迁移率与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。根据以上因素我们可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。核酸分子的糖磷酸骨架中的磷酸基团带负电荷，当核酸分子被放置电场中时，它们就会向正电极的方向迁移，由于糖磷酸骨架结构上的重复性质，一样数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能

7、以同样的速度向正电极方向迁移，分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移要快些。蛋白质有不同的电荷和复杂的形状，当放电动势在样品上，蛋白质可能会以不同的速度进入凝胶或完全不移动，而蛋白质在有洗涤剂如十二烷基硫酸钠或十二烷基磷酸钠出现时会变性，洗涤剂会以负电荷覆盖蛋白质，所以键结后变质的蛋白质带有负电荷，而且所有蛋白质有相似的“荷质比”（电荷和质量的比值）。在跑完电泳，最小的分子几乎都到达氧化极之后，可以对凝胶里的分子染色，这样才能看到分子。可以用溴化乙锭，银或考马斯亮蓝染色，也可以用其他方法看到凝胶里分离后的混合物组成，如果分析物的分子在紫外线下会发光，就可以在紫外线下拍出凝胶的照片，

8、如果要分离的分子有放射性原子，就可以用同位素示踪剂记录。如果一开始有很多个混合物一个接一个注入相邻的“井”，跑出来的结果会是一条一条平行的轨迹。根据不同分子的数量，每一条轨迹都有一条或以上，明显的亮带，表示原本混合物分离出来的组成，每个亮带代表一个组成，组成物分离不完全就会跑出重叠的亮带，或者难以辨别的污点就表示许多组成物没有分解。第三部分 特点凝胶电泳的电泳迁移率是指在单位电场强度时带电分子的迁移速度，而迁移率与带电分子所带静电荷和所处电场电场强度成正比，与分子的大小和缓冲液的摩擦系数成反比。（一）电场强度电场强度是指单位长度的电位降，也称电势梯度。电场强度愈大，带电颗粒的泳动越快。但凝胶的

9、有效分离围随着电压增大而减小。（二）样品的物理性质（1）分子大小当核酸分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开，此时电泳的迁移率与分子大小无关。（2）分子空间构型当分子空间构型不同，其迁移率也不同。（3）分子带电量不同核酸分子的电荷密度大致一样对迁移率影响不大。（4）分子碱基组成不同核酸分子碱基组成对迁移率影响不大。（三）支持物的物理性质凝胶浓度越小，孔径越大；浓度越大，孔径越小。琼脂糖是线性多聚体大分子，含有不同浓度琼脂糖的凝胶构成分子筛的网孔大小不同，适于分离不同浓度围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺在交联剂N,N,N,N-四甲基乙二胺和催化

10、剂过硫酸铵的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，其网孔的大小由两物质的相对比例决定。第四部分 应用一、琼脂糖凝胶电泳（一）简介琼脂糖主要从琼脂中提取而来并经糖基化修饰，是一种聚合链线性分子，琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，并随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。 （琼脂糖结构式）使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，物质分子通过会受到阻力，大分子物质在泳动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带点颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子的大小，这就大大提高了分辨能力。根据相关性质，可以分为：（1）低熔点

11、凝胶，用于DNA片段的回收、酶切、连接等。（2）高熔点凝胶，用于分离小于1kb的DNA片段， PCR产物的分析。（3）快速凝胶，电泳速度较快，节省实验时间。（4）其他类型，依据机械强度和熔点选择。（二）特点（1）凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。（2）操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率可以达到大多数实验的要求，成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。（3）琼脂糖凝胶因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗。（4）对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。（5）透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。（6）不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定。（

12、7）机械强度差，易破碎，浓度不能太低，易被细菌污染，不易保存。二、聚丙稀酰胺凝胶电泳（PAGE）（一）简介聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。带有酰胺侧链，没有或很少有带离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。根据凝胶溶液和电泳缓冲液对蛋白质构象的影响，可分为两种方式:一是非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状与其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开，在未变凝胶中分离DNA的缺点是DNA 的迁移率受碱基组成和序列的影响。由于无法得知未知 DNA的迁移是否反常，故不能用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳来

13、确定分子的大小。二是用于分离与纯化单链DNA 片段的变性聚丙烯酰胺凝胶。这类凝胶是在核苷酸碱基配对抑制剂（尿素或甲酰胺）的存在下聚合而成的。变性DNA的移动速度同其碱基组成与序列几乎完全无关，故可用于分离与纯化单链DNA片段和DNA测序等。（二）特点（1）具有分子筛效应，分辨率高（2）样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10（3）化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基，具有稳定的亲水基团（4）凝胶不带电荷，消除了电渗现象（5）机械强度好，有弹性，在一定浓度围无色透明（6）网孔可调节（三）十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）仅根据蛋白质亚基分子量的不同就

14、可以分开蛋白质。该技术最初由Shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基硫酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。十二烷基硫酸钠是一种阴离子去污剂，在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在。这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子间以与与其他物质分子间的非共价键，使蛋白质分子的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合从 （SDS结构示意图）而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。蛋白质分子与SDS结合后所带上的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电量，因而也就掩盖或消除了不

15、同种类蛋白质分子间原有的电荷差异。这样的蛋白质-SDS复合物在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率便不再受蛋白质原有电荷和形状等因素的影响，而主要取决于蛋白质分子量大小。当蛋白质的分子质量在15000-20000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下列方程式：lgMw=-b.Mr+K .式中，MW为蛋白质的分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，K为截距，在条件一定时，b和K均为常数。采用SDS-PAGE系统作单向电泳，不仅可以根据分子量大小对蛋白质进行分离，而且可以根据电泳迁移率大小测定蛋白质的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS

16、电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白与设计提纯过程都是非常重要的。三、脉冲电场凝胶电泳（一）简介一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA，这是因为在琼脂糖凝胶中，DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，电场作用迫使DNA变形挤过筛孔沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响不大，此时凝胶介质的分子筛效应不明显。脉冲电场凝胶电泳是在琼脂糖凝胶上外加正交的交变脉冲电场，其方向、时间与电流大小

17、交替改变，每当电场方向发生改变，大分子的DNA便滞留在爬行管，直至沿新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动，DNA分子越大，这种重排所需时间就越长，当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA就可以按其分子量大小分开，因此分辨力较高，是用于分离大分子量线状DNA分子的一种电泳方法。（二）应用（1）用于分离线状DNA，从环状DNA中分离出线状DNA的技术称作脉冲场聚丙烯酰胺凝胶电泳，先采用在钳位均匀电场中的水平聚丙烯酰胺凝胶电泳，后改在电场转凝胶电泳条件下的缓冲溶液非连续性垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳，从而使分离简单，有效。（2）用于分离EB病毒基因组，EB病毒不能在其转化的淋巴细胞中引起大量

18、溶解性感染，因此采用常规方法分离EB病毒DNA比较困难，以往的分离方法需要从大量的部分感受态B-淋巴细胞培养物中增殖病毒粒子，故分离到的纯EBDNA量很少，采用PFGE分离技术则能获得更多的量。（EB病毒）（3）用于研究大分子复合物如何形成生物系统，通过提高成熟线形双链细菌DNA和体外成熟细菌DNA末端连接复合物的分离长度，提高细菌DNA环状形式的分离，提高线状单链细胞DNA的分离，提供分析蛋白质-DNA复合物的相对简单的方法，提供比液相阶段更为简单和有效的、对所有细菌DNA进行定量分析的固相阶段分析法来达到目的。（4）用于研究细胞凋亡，因凋亡时DNA的降解先于细胞形态学的变化，故敏感、特异地

19、检测降解DNA的片段梯度被认为是检测细胞凋亡的标志。四、不连续凝胶电泳不连续凝胶电泳在有较高pH值的电泳胶聚合后，在此基础上再制备一段低于pH值的大孔径堆积凝胶，当给两极施加电场，缓冲离子从上方的缓冲液库向堆积凝胶迁移，上方缓冲库中缓冲阴离子进入堆积凝胶后，凝胶中的pH值比它们自身的pK值要低得多，因此变成电中性，引起导电体的缺乏，于是堆积凝胶中电阻增大，大部分电场就加在堆积凝胶上，导致蛋白质分子在堆积凝胶中的迁移速度比在电泳胶得多，致使所有蛋白质分子在两种凝胶的界面上密集，当低pH值的缓冲离子从堆积凝胶中迁出，所有缓冲离子都是高pH值，两种凝胶电阻率一样，各种蛋白质分子再同时从界面向正极迁移

20、，可使试样带变窄，提高分辨率。五、等电点聚焦电泳（一）简介等电点聚焦是根据蛋白质的净电荷或者等电点的差别来进行分离，将试样至于pH梯度的凝胶中，蛋白质在电场作用下沿着pH值梯度方向迁移，当达到某一位置时，在该pH条件下，其净电荷为零，因此不再移动，由于许多蛋白质都有其特定的等电点，因而可将蛋白质分离开来。丙酰胺衍生物作缓冲液可使梯度缓冲离子固定化，其中R为羧酸基或季铵基，每种缓冲液都有一特定的pK值，衍生物与丙烯酰胺一起聚合，在聚合之前和聚合过程中施加电场，在电场的作用下各种缓冲液按pH值高低顺序自动排列成序，这样在电场作用下，各缓冲液按pK高低次序自动排列成pH梯度，当整个凝胶聚合后，各缓冲

21、液被聚合到凝胶中而固化，因而可利用pH梯度准确地分离具有不同等电点的各种蛋白质，提高分辨率。高电场可提高等电点聚焦的分离效果，但需要有效地散热，在试样处理过程中，要注意防止蛋白质的任何化学组成或结构的改变，以免引起等电点的移动。（二）特点（1）分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定蛋白或多肽的等电点。（2）需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白。六、二维凝胶电泳二维凝胶电泳首先在第一维空间用等电点电泳区分等电点不同的蛋白质，然后将色带切下放入十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中将分子量不同的蛋白质区分开来，等候一段时间让两种凝胶预先达到平衡，再进行第二维电泳，可分辨500

22、0种左右的蛋白质。七、双向凝胶电泳双向凝胶电泳技术是唯一一种可同时分离上千种蛋白质的方法，可承载几毫克蛋白质样品，将其分离成上千个蛋白点。但传统的双向电泳技术存在局限性，例如效率不同造成胶与胶之间重复性差，存在误差使得很难区分蛋白点丰度的变化是来源于实验误差还是诱发产生的生物学变化，难以将蛋白质表达量的变化定量，疏水性膜蛋白以与高度酸性或碱性的蛋白的溶解度差导致其在双向电泳第一向等电聚焦中难以溶解造成蛋白质的损失，高丰度蛋白的动态围超过了检测可能性的动态围导致低丰度蛋白难以检测，单一分离难以应对大规模的蛋白组学分析等。九、差异凝胶电泳差异凝胶电泳技术建立在双向电泳技术的基础上，以在双向电泳前先对蛋白样品进行荧光标记为基础，能够在同一块双向电泳胶中进行两个蛋白质样品差异的检测与定量，从而可以避免传统双向电泳技术胶与胶之间重复性差的缺陷。 （荧光染料）由于荧光染料的敏感性与线性，差异凝胶电泳技术与其他标准的染色技术相比具有更加精确的定量能力，另外差异凝胶电泳技术不需要进行电泳后的固定或脱色过程，可减少蛋白质尤其是低分子量蛋白质的损失，而且可以在同一块凝胶中比较两个不同的蛋白样品，胶与胶之间变化的影响完全消除，使得蛋白点荧光强度的差异是