血型的鉴定方法及操作

1、红细胞血型系统及其检测红细胞血型系统及其检测重庆医科大学临床血液教研室重庆医科大学临床血液教研室血型的发现血型的发现n1900年，年，ABO血型系统血型系统n1940年，年，Rh血型系统血型系统 Karl Landsteiner血型（血型（blood type)n狭义地讲，存在于红细胞上的特异性同种抗原。狭义地讲，存在于红细胞上的特异性同种抗原。n广义地讲，是人类遗传多态性的一种表现，血广义地讲，是人类遗传多态性的一种表现，血液中各种成分都有其各自型别。液中各种成分都有其各自型别。红细胞血型（系统，抗原）红细胞血型（系统，抗原）n是存在于红细胞上的化学结构，化学本质是糖是存在于红细胞上的化学结

2、构，化学本质是糖和多肽，是红细胞膜上的和多肽，是红细胞膜上的跨膜蛋白跨膜蛋白。n存在于红细胞膜上（完全抗原），也存在于上存在于红细胞膜上（完全抗原），也存在于上皮细胞以及各种体液和分泌液中（半抗原）。皮细胞以及各种体液和分泌液中（半抗原）。RBC存在于体液、分泌液中存在于体液、分泌液中红细胞血型抗体红细胞血型抗体n天然抗体、免疫抗体天然抗体、免疫抗体n规则抗体、不规则抗体规则抗体、不规则抗体n完全抗体，不完全抗体完全抗体，不完全抗体n同种抗体，自身抗体同种抗体，自身抗体天然抗体和免疫抗体天然抗体和免疫抗体n天然抗体：天然抗体：ABO血型系统中，血型系统中，A型个体血浆中型个体血浆中天然存在抗天

3、然存在抗B，B型个体血浆中存在抗型个体血浆中存在抗A。多。多数天然抗体是数天然抗体是IgM型，最佳反应温度为型，最佳反应温度为室温室温或或更低。更低。n免疫抗体：一般通过输血、妊娠、注射三种方免疫抗体：一般通过输血、妊娠、注射三种方式接受抗原刺激，多数免疫抗体是式接受抗原刺激，多数免疫抗体是IgG型，最型，最佳反应温度是佳反应温度是37oC。天然抗体和免疫抗体特性比较天然抗体和免疫抗体特性比较规则抗体和不规则抗体规则抗体和不规则抗体n规则抗体：规则抗体：ABO系统产生抗、抗是有规律的。系统产生抗、抗是有规律的。Landsteiner规律：规律：型抗，型抗，型抗，抗型抗，型抗，型抗，抗n不规则抗

4、体：除不规则抗体：除ABO 系统外，其他系统产生的抗体系统外，其他系统产生的抗体均不符合上述规律。均不符合上述规律。正常人血液中一般没有不规则抗体正常人血液中一般没有不规则抗体，又称为意外抗体，又称为意外抗体（unexpected antibody）。）。完全抗体和不完全抗体完全抗体和不完全抗体n完全抗体：完全抗体：在盐水介质中能凝集红细胞抗体，多为在盐水介质中能凝集红细胞抗体，多为IgM抗体。抗体。n不完全抗体不完全抗体：能使红细胞致敏，但在盐水质中不能凝集红细胞，：能使红细胞致敏，但在盐水质中不能凝集红细胞，需要通过抗球蛋白法或其他非盐水介质法进行检测，多为需要通过抗球蛋白法或其他非盐水介

5、质法进行检测，多为IgG抗体。抗体。抗抗IgG同种抗体、自身抗体同种抗体、自身抗体n同种抗体：针对患者缺乏的抗原所产生的抗体同种抗体：针对患者缺乏的抗原所产生的抗体即为同种抗体，如即为同种抗体，如Rh阴性者输血后产生的抗阴性者输血后产生的抗抗体。抗体。n自身抗体：针对自身抗原产生的抗体，如引起自身抗体：针对自身抗原产生的抗体，如引起自身免疫型溶血性贫血。自身免疫型溶血性贫血。红细胞血型红细胞血型n红细胞血型分类：红细胞血型分类： ISBT（The International Society of Blood Transfusion) 2002年，年，29个系统，个系统，200多个抗原多个抗原

6、目前，目前，30个系统，个系统，300多个抗原多个抗原一、一、ABO血型系统血型系统1. ABO血型抗原和抗体特性血型抗原和抗体特性2.ABO血型的遗传与生化血型的遗传与生化（1）ABO基因型与表型基因型与表型 A型型AA，AO B型型BB，BO AB型型AB O型型O A，B是显性基因，是显性基因，O是隐性基因是隐性基因 ABO基因不是产生基因不是产生ABO抗原的遗传密码抗原的遗传密码（2）ABO血型的生化合成血型的生化合成nH基因基因 L-fucocyltransferase，19chr nA基因基因 N-acetyl-0-galactosaminyltransferase，9chr nB

7、基因基因galactosyltransferase, 9chrnO基因基因无效基因，不产生转移无效基因，不产生转移酶，酶，O型红细胞含有型红细胞含有H物质物质基因基因酶酶合成抗原合成抗原思考：思考：A、B、AB型红细胞是否存在型红细胞是否存在H物质？物质？（3）ABH可溶性抗原形成可溶性抗原形成n分泌型血型物质：分泌型血型物质：ABH抗原存在于红细胞、抗原存在于红细胞、内皮细胞、血小板、淋巴细胞、上皮细胞等，内皮细胞、血小板、淋巴细胞、上皮细胞等，也可出现在除脑脊液外的分泌液中，也可出现在除脑脊液外的分泌液中，唾液中最唾液中最丰富。丰富。nSe，se基因基因与体液分泌有关，与体液分泌有关，Se

8、编码编码 L-fucocyltransferase，形成分泌液中的，形成分泌液中的H抗抗原，原，H也可转化为也可转化为A或或B抗原，抗原，Se不影响红细不影响红细胞上胞上ABH形成形成，Se为分泌型；为分泌型；se为非分泌型；为非分泌型；19chr。分泌型血型物质的意义：分泌型血型物质的意义：n在在RBC抗原弱表达个体中确定抗原弱表达个体中确定ABO血型。血型。n检测唾液、羊水中的血型物质，辅助鉴定血型检测唾液、羊水中的血型物质，辅助鉴定血型和预测胎儿血型。和预测胎儿血型。n能中和天然抗体（能中和天然抗体（IgM），有助鉴别），有助鉴别Ab性质。性质。3.ABO亚型：亚型：n亚型：同一血型抗原

9、的亚型：同一血型抗原的结构、性能（质）结构、性能（质）或或抗抗原位点数（量）原位点数（量）存在一定差异。存在一定差异。nA亚型：A1，A2，A3，Ax，Ay，AmnB亚型：B1，B2，B3，Bx，Bm二、二、Rh血型系统血型系统n1940年，年，Landerstein和和Wiener用恒河猴用恒河猴（rhesus）RBC免疫家兔或豚鼠，得到一种免疫家兔或豚鼠，得到一种抗体，可与抗体，可与85%白种人红细胞发生反应。白种人红细胞发生反应。nRh系统有系统有50个抗原，最复杂，重要性仅次于个抗原，最复杂，重要性仅次于ABO血型。血型。1.遗传与发育规律遗传与发育规律n胎儿早期充分发育，脐带血胎儿早

10、期充分发育，脐带血/新生儿红细胞同新生儿红细胞同成人。成人。n基因位于基因位于1chr，分别命名为，分别命名为RHD，RHCE，RHD编码编码D抗原，抗原，RHCE编码不同组合的编码不同组合的CE抗抗原，原，ce，cE，Ce，CE。2.命名和种类命名和种类n三种命名方式三种命名方式 Fisher-Race、数字命名法、现代命名法、数字命名法、现代命名法Fisher-Race命名法（命名法（CDE命名法）命名法）3.Rh血型种类血型种类nD、E、C、e、cn抗原的强弱次序抗原的强弱次序 DECce5.Rh抗体抗体nRh抗体产生抗体产生 天然抗体罕见天然抗体罕见 主要通过输血和妊娠免疫产生主要通过

11、输血和妊娠免疫产生IgG 初次免疫后初次免疫后36月出现，再次免疫后月出现，再次免疫后3周达高周达高峰峰nRh抗体种类抗体种类 抗抗D，抗，抗E，抗，抗C，抗，抗c，抗，抗eABO和和Rh血型系统的临床意义血型系统的临床意义n安全输血的主要保证安全输血的主要保证n新生儿溶血病的诊断新生儿溶血病的诊断n器官移植的必要条件器官移植的必要条件n其他：遗传学研究，法医学鉴定其他：遗传学研究，法医学鉴定四、四、ABO和和Rh血型鉴定血型鉴定n常用方法：常用方法： 盐水介质法、酶介质法、抗人球蛋白法、聚凝盐水介质法、酶介质法、抗人球蛋白法、聚凝胺法胺法 试管法、玻片法、微柱凝胶法试管法、玻片法、微柱凝胶法

12、1.盐水介质法（盐水介质法（salt medium test）n原理：根据原理：根据IgM类抗体与红细胞膜上特异性抗类抗体与红细胞膜上特异性抗原能发生凝集反应。原能发生凝集反应。 正定型：已知血型抗体试剂正定型：已知血型抗体试剂 + 红细胞红细胞 反定型：已知标准红细胞反定型：已知标准红细胞 + 血清血清鉴定红细胞上血型抗原鉴定红细胞上血型抗原鉴定血清中抗体鉴定血清中抗体n反应条件：生理盐水介质，室温，肉眼可见凝反应条件：生理盐水介质，室温，肉眼可见凝集反应集反应n平板法，试管法，微孔板法，平板法，试管法，微孔板法，试管离心法最可试管离心法最可信赖。信赖。n应用：应用：ABO血型定型、血型定型

13、、RhD抗原定型抗原定型（IgG+IgM，IgM单克隆抗体单克隆抗体），交叉合血），交叉合血结果判断结果判断注意事项（一）：注意事项（一）：n标准血清：标准血清：健康壮年人混合血清，培养细胞株健康壮年人混合血清，培养细胞株的单克隆抗体的单克隆抗体n要求：要求： 高效价：抗高效价：抗A、抗、抗B1：128 高亲和性：高亲和性：15s内出现凝集，内出现凝集，3min后凝集块后凝集块 1mm1mm2 2 单克隆抗体具有检出单克隆抗体具有检出A2A2，A2BA2B的能力的能力 冷凝集素效价冷凝集素效价 1 1：4 4 无菌，病毒灭活无菌，病毒灭活注意事项（二）：注意事项（二）：n红细胞试剂红细胞试剂：

14、三个健康者同型新鲜红细胞混合，：三个健康者同型新鲜红细胞混合，用生理盐水洗涤三次。用生理盐水洗涤三次。n红细胞悬液不能过浓或过淡，红细胞悬液不能过浓或过淡，5%生理盐水红生理盐水红细胞悬液细胞悬液注意事项（三）：注意事项（三）：n所有器材清洁干燥所有器材清洁干燥n一般先加血清，后加红细胞一般先加血清，后加红细胞n反应温度：反应温度：IgM抗体反应最适温度为抗体反应最适温度为40C，为防，为防止冷凝集素干扰，采用室温，止冷凝集素干扰，采用室温，370C反应减弱反应减弱n离心时间和速度：离心时间和速度：3000g,30sn反定型不宜用玻片法反定型不宜用玻片法n结果核对，避免笔误结果核对，避免笔误n

15、正、反定型结果一致才能报告，否则查找原因正、反定型结果一致才能报告，否则查找原因正反定型不一致的可能原因（一）：正反定型不一致的可能原因（一）：n操作技术上的错误：主要原因操作技术上的错误：主要原因 离心过度或不足离心过度或不足 细胞与血清反应比例不适当细胞与血清反应比例不适当 阳性反应产生溶血现象而未能识别阳性反应产生溶血现象而未能识别 漏加试剂、结果判读错误等漏加试剂、结果判读错误等 正反定型不一致的可能原因（二）正反定型不一致的可能原因（二）：n出现假阴性的常见原因：出现假阴性的常见原因： 某些白血病患者和难治性贫血等导致某些白血病患者和难治性贫血等导致ABO抗抗原减弱；原减弱； 免疫系

16、统尚未健全的新生儿、免疫系统尚未健全的新生儿、4月月6月内婴儿、月内婴儿、抗体水平下降的老人；抗体水平下降的老人； 亚型红细胞抗原性弱，难以检出；亚型红细胞抗原性弱，难以检出； 低丙种球蛋白血症患者，血清定型时不凝集或低丙种球蛋白血症患者，血清定型时不凝集或弱凝集。弱凝集。 正反定型不一致的可能原因（三）正反定型不一致的可能原因（三）n出现假阳性的常见原因：出现假阳性的常见原因： 红细胞出现多凝集现象；红细胞出现多凝集现象； 严重肠道革兰氏阴性杆菌感染，可使红细胞获得类严重肠道革兰氏阴性杆菌感染，可使红细胞获得类B现象；现象； 异常的血浆蛋白升高、白蛋白异常的血浆蛋白升高、白蛋白/球蛋白异常，

17、高浓度纤球蛋白异常，高浓度纤维蛋白原造成假凝集现象；维蛋白原造成假凝集现象； 待检血清中有不规则抗体存在；待检血清中有不规则抗体存在； 右旋糖酐、静脉注射某些造影剂等引起红细胞右旋糖酐、静脉注射某些造影剂等引起红细胞 类似凝类似凝集。集。 方法学评价方法学评价n简单，灵敏度低，只适合简单，灵敏度低，只适合IgM抗体抗体n试管法：需时短，离心增强凝集，可发现亚型试管法：需时短，离心增强凝集，可发现亚型和较弱的反应，正、反定型皆适合和较弱的反应，正、反定型皆适合n玻片法：适合大规模血型普查，反应时间长，玻片法：适合大规模血型普查，反应时间长，有时漏掉弱反应，反定型不适合。有时漏掉弱反应，反定型不适

18、合。2.酶介质法（酶介质法（enzymic medium test）：）：n原理和方法：主要用于原理和方法：主要用于Rh血型鉴定（血型鉴定（IgG抗体）抗体）蛋白水解酶蛋白水解酶增强增强IgG抗体抗体的凝集作用的凝集作用注意事项：注意事项：nRh血型不需作反定型血型不需作反定型n每次实验均需作阳性、阴性对照每次实验均需作阳性、阴性对照方法学评价方法学评价n简单经济简单经济n稳定性、准确性较差，不能检出稳定性、准确性较差，不能检出MN、Duffy血血型系统型系统3.抗人球蛋白实验（抗人球蛋白实验（Coombs test）n原理和方法原理和方法抗抗IgG待测红细胞待测红细胞 + 抗抗RhD（IgG

19、）+ 抗人球蛋白抗人球蛋白红细胞凝集红细胞凝集应用延伸：应用延伸：n检测红细胞同种抗体的经典方法，新生儿溶血、病、溶血性输血反应、自身免疫性溶血性贫血n直接Coombs（direct antiglobulin test, DAT）n间接Coombs（indirect antiglobulin test, IDAT）DAT：检查红细胞是否致敏：检查红细胞是否致敏IDAT：检测血清中不完全抗体：检测血清中不完全抗体4.聚凝胺介质法（聚凝胺介质法（polybrene test）n原理和方法原理和方法 低离子强度盐溶液低离子强度盐溶液（low ionic strength salt solution,

20、 LISS)：降低介质离子强度，增加抗原抗体结合：降低介质离子强度，增加抗原抗体结合 聚凝胺：聚凝胺：中和红细胞表面负电荷，使红细胞发生非特异性中和红细胞表面负电荷，使红细胞发生非特异性凝集。凝集。 重悬液重悬液（resuspension)方法学评价方法学评价n适于各类抗体（适于各类抗体（IgM，IgG）n快速、灵敏、可靠快速、灵敏、可靠n对检测对检测Kell血型系统抗体不理想，不能用肝素血型系统抗体不理想，不能用肝素抗凝。抗凝。5.微柱凝胶法微柱凝胶法(gel cards with microtubes)n1986年法国人Dr. Yves Lappierre发明n1994年，获美国FDA认证原理和方法原理和方法n葡聚糖做成微型凝胶柱，葡聚糖做成微型凝胶柱，上端为反应室，下端凝上端为反应室，下端凝胶柱为抗原抗体凝集反胶柱为抗原抗体凝集反应的介质。应的介质。n抗原与抗体结合后离心，抗原与抗体结合后离心，经过凝胶分子筛作用，经过凝胶分子筛作用，游离红细胞在凝胶底部，游离红细胞在凝胶底部，而与抗体结合凝集的红而与抗体结合凝集的红细胞位于凝胶上部或悬细胞位于凝胶上部或悬浮于凝胶中。浮于凝胶中。 反应室反应室凝胶柱凝胶柱结果判读：结果判读：n阳性结果：红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中，和阳性结果：红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中，和（或）出现溶血。（或）