ELISA实验基础知识培训

1、ELISA实验基础知识培训2016.1.21. 酶联免疫吸附实验（ELISA）基本原理及概念2. 酶联免疫吸附实验（ELISA）定量检测应用3. ELISA实验主要设备移液器基本使用主要内容第一部分 酶联免疫吸附实验（ELISA）基本原理及概念免疫技术酶促反应抗原抗体酶底物酶标抗原或酶标抗体酶联免疫吸附试验5什么是抗原？ 能刺激机体免疫系统并启动机体的免疫应答，且能与其免疫应答产物(抗体或免疫效应细胞)特异性结合，引起一系列生物学效应的物质。抗原特异性抗体6抗原的特点免疫原性和抗原性 免疫原性免疫原性 指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答( (产生特异性产生特异

2、性抗体及免疫效应细胞抗体及免疫效应细胞) )的性质。的性质。 抗原抗原入侵入侵记忆细胞（对抗原有记忆功能）浆细胞特异性抗体效应B细胞7 抗原性抗原性 指抗原分子与免疫应答产物指抗原分子与免疫应答产物( (抗体或免疫效应细胞抗体或免疫效应细胞) )发生发生特异性结合的性质。特异性结合的性质。抗原失去致病能力8 抗原决定簇大多存在于抗原物质的表面，有些存在于抗原物质的内部，须经酶或其他方式处理后才暴露出来。一个天然抗原物质可有多种和多个决定簇。抗原分子越大，决定簇的数目越多。抗原决定簇：抗体识别相应抗原并与之结合的位点抗原决定簇抗原决定簇具有两个以及两个以上抗原决定簇的抗原叫多价抗原9哪些物质可以

3、称之为抗原呢？大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素等都是抗原。 可以引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染金黄色葡萄球菌常引起严重腹泻和败血症10 病毒呈球形，衣壳由60个壳微粒组成，呈20面体立 体对称，有HAV的特异性抗原(HAVAg)，每一壳微粒由4种不同的多肽（蛋白质）即VP1、VP2、VP3和VP4所组成 甲肝病毒1973年Feinslone 首先用免疫电镜技术在急性期患者的粪便中拍摄的甲型肝炎病毒 (Hapatitis A virus,HAV ) 11甲肝病毒表面的VP蛋白是具有免疫原性的蛋白，能刺激免疫系统产生特异性的抗体甲肝病毒12什么是抗体？ 抗体是在机

4、体对抗原刺激的免疫应答中，效应B细胞产生的一类糖蛋白，能够与相应抗原特异结合、产生各种具有免疫效应的球蛋白。免疫球蛋白 在甲型肝炎的感染过程中，机体都可产生抗HAV的lgM 和lgG抗体。前者在急性期和恢复期出现，后者在恢复后期出现，并可维持多年，IgG 抗体使得机体对同型病毒的再感染有免疫力。13什么是抗原抗体反应 抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应抗原抗体反应的特点1. 特异性抗原与抗体结合反应的专一性，是指抗原分子表面的抗原决定簇与抗体的分子结合的特异性，这两个分子的空间结构是完全互补的。142.可逆性抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗

5、体3. 阶段性第一阶段第一阶段特异性结合阶段：反应快，不可见第二阶段第二阶段反应可见阶段：反应慢，但会出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象我可找到你了15抗原抗体反应的特点4.比例性抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比例关系 只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应，形成的免疫复合物沉淀最多、最大。而当抗原抗体比例超过此范围时，反应速度和沉淀物量都会迅速降低甚至不出现抗原抗体可见沉淀反应。沉淀物形成量沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系16你们都看不见我17放射性免疫标记技术18放射性免疫标记技术 用放射性核素等标记物，标记抗体或抗原，进行的抗原抗体检测技术，既有

6、抗原抗体反应的特异性，又有标记物的灵敏度。通过放射强度的改变，测定未标记抗原或抗体的含量。（放射性标记物对抗原抗体反应起到了放大的作用）缺点：放射性物质对人体会产生危害 1959年由Yalow和Berson开创了放射免疫技术(radioimmunoassay，RIA）。这项技术开辟了医学检验史上的一个新纪元。它使得那些原先认为是无法测定的极微量而又具有重要生物学意义的物质得以精确定量。酶具有可与抗原、抗体共价结合的基团高活性一个酶蛋白分子每分钟可以催化103-104个底物分子转化为有色产物 用酶标记抗体（或抗原）建立免疫测定法，可以使免疫结果得以放大，保证了测定方法的灵敏度。20Nakene和

7、Pierce共同研究发现的酶标抗原或抗体的方法，他们共同发表了酶标抗体：制备和抗原定位中的应用，首先提出了免疫酶技术的基本原理酶标记抗原或抗体酶标抗原或抗体的原理及方法戊二醛交联法 过碘酸钠法 目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。采用辣根过氧化物酶的原因分子量小：这使得它很容易结合到抗体分子上，且结合量大大增加，有助于信号的产生。辣根过氧化物酶的底物比较宽泛，且比碱性磷酸酶敏感。酶标抗体或抗原的原理 辣根过氧化物酶中与酶活性无关的糖蛋白组分，在过碘酸钠作用下，其中的多糖羟基被氧化成活泼的醛基，后者

8、即可与抗体蛋白中的氨基形成的Schiffs碱而交联，再经硼氢化钠还原终止反应，即得到稳定的酶标结合物辣根过氧化物酶糖蛋白过碘酸钠抗体蛋白氨基氨基羟基醛基Schiffs碱 酶标抗体或抗原技术基本要求是将酶分子与抗体或抗原分子共价结合 此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性22在实验中，为了分离游离和结合的酶标记物，洗板的过程是必不可少的，所以，将抗原（抗体）固定在固相载体上就是必须的了将抗原（抗体）固定在什么固相载体上？呀！我没结合上固相载体23塑料制品 抗体或蛋白质抗原可以通过非共价键或物理吸附机制结合到固相载体表面。迄今用的聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板仍是最常

9、用的固相载体Wide 和Jerker Porath研究并公开发表了抗原或抗体和固相载体结合的技术不足测定过程中固相抗体（抗原）脱吸附率较高且不均一，从而影响测定的灵敏度和精确性由于制作时配料及生产工艺的差别，各种聚苯乙烯ELISA板的质量差异大，会影响检测结果优点材料经济方法简便操作及测定易于自动化24Rosalyn Sussman Yalow 和Solomon Berson建立了放射性免疫技术，可以定量检测体液中的生物活性物质1960年Stratis Avrameas 和G. B. Pierce发现了酶和抗体结合技术Wide 和Jerker Porath研究并公开发表了抗原或抗体和固相载体结

10、合的技术1961-1965年1971年Engral和Perlmann综合了前人技术，第一次提出酶联免疫吸附试验，并发表酶联免疫吸附试验测定IgG含量一文，使免疫酶技术成为一种实用的检测液体标本中微量物质的方法 捕获法捕获法01 间接法间接法02 竞争法竞争法03双抗体夹心法双抗体夹心法04ELISA的分类ELISA方法的适用范围间接法捕获法主要用于血清中某种抗体亚型成分，如：IgM的测定。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。竞争法可用于小分子的抗原和半抗原的定量测定，以及抗体测定。小分子激素、药物等的测定多用此法双抗体夹心法最常用于抗原检测，且为

11、多价抗原检测。但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心此法是检测抗体最常用的方法用途广泛1敏感度高2特异性强3可定性和定量4ELISA方法的特点28双抗体夹心法原理：利用连接于固相载体上的 和 可分别于样品中被检测抗原分子上两个不同抗原决定簇结合，形成 免疫复合物。 由于反应系统 和 相对于待检测抗原是过量的，因此复合物形成的量和待检抗原的含量成正比。测定复合物酶中加入的底物后生成的有色物质（OD值），即可确定待测抗原的含量。（成正比）抗体 酶标抗体过量过量固相抗体-抗原-酶标抗体固相抗体-抗原-酶标抗体固相抗体酶标抗体的量29将抗体包被在固相载体上将抗体固定在固相载体上

12、抗体作为一种蛋白质可以与聚苯乙烯制成的固相载体以非共价键和物理吸附的机制相结合洗去未结合的抗原洗去未与抗原结合的酶标抗体TMB底物终止液终止液2mol/LH2SO4酶和底物作用后生成的物质在终止剂作用下呈现黄色，黄色的深浅和抗原含量成正比双抗体夹心法操作甲肝疫苗抗原检测的方法双抗体夹心法 采用ELISA双抗体夹心法定量/定性检验甲肝抗原。 将特异性甲肝抗体（包被物）包被到酶标板上形成固相抗体； 加入参比品和供试品，与固相抗体形成抗原抗体复合物 随后加入酶标抗体，参比品和供试品中的甲肝抗原与酶标抗体发生特异性结合 当加入酶底物时，出现呈色反应，酶标仪在适当波长测定参比品以及供试品的OD值 应用量

13、反应平行线法计算抗原含量。甲肝疫苗抗原检测方法原理第二部分 酶联免疫吸附实验（ELISA）定量检测应用目录 国际法规对生物分析方法验证的要求 双抗夹心ELISA检验方法实例和验证介绍 ELISA分析模型的选择Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration (FDA) Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Vete

14、rinary Medicine (CVM) May 2001FDA对生物分析方法验证的要求Typical method development and establishment for a bioanalytical method include determination of (1)selectivity, (2) accuracy, precision, recovery, (3) calibration curve, and (4) stability of analyte in spiked samples生物学分析方法的验证项目包括：（1）专属性；（2）准确度、精密度、回收率；（

15、3）标准曲线；（4）稳定性34精密度的概念The precision of an analytical method describes the closeness of individual measures of an analyte when the procedure is applied repeatedly to multiple aliquots of a single homogeneous volume of biological matrix.精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差（SD）或变异系数（或

16、称相对标准偏差）来表示。 偏差、标准偏差（SD）或变异系数越小，说明测定结果越集中，精密度越好。精密度的验证结果表明了这个检验系统检验供试品结果的波动幅度。Precision should be measured using a minimum of five determinations per concentration. A minimum of three concentrations in the range of expected concentrations is recommended. The precision determined at each concentratio

17、n level should not exceed 15% of the coefficient of variation (CV) except for the LLOQ, where it should not exceed 20% of the CV which measures precision with time, and may involve different analysts, equipment, reagents, and laboratories.生物分析方法精密度评价的规定：对生物分析方法进行精密度检测实验时，检测范围内最少设置3个不同浓度，每个浓度最少进行5次重复

18、试验。考察因素：时间、人员、设备、试剂和实验室导致结果的因素验证结果：在相同浓度下，试验结果变异系数CV应小于15%（最低检出限的要求是CV小于20%）。FDA对生物分析方法验证的要求 Once the analytical method has been validated for routine use, its accuracy and precision should be monitored regularly to ensure that the method continues to perform satisfactorily. To achieve this objectiv

19、e, a number of QC samples prepared separately should be analyzed with processed test samples at interval based on the total number of samples. The results of the QC samples provide the basis of accepting or rejecting the run. At least four of every six QC samples should be within 15% of their respec

20、tive nominal value. Two of the six QC samples may be outside the 15% of their respective nominal value, but not both at the same concentration.Application of validated method to routine drug analysis已验证方法在常规检验中的应用-FDA当生物分析方法建立并开始用于常规检定后，需要定期监控该生物分析方法的精密度和准确性，以确保分析方法的运行是可靠的。采取的方法是，在检验过程中，定期设置质控品；根据质控

21、品的结果来判定实验是否成立。要求：要求：至少4/6的质控品的测定结果在真实结果的15%范围内；2/6的质控品测定结果超出真实结果真实结果的15%间接证明：生物分析方法的波动还是很大的质控品甲型肝炎灭活疫苗内控参比品（内参）内参设置频次每块酶标板设置1个内参内参成立要求体外效力检验值在1.04-1.28之间，试验成立内参均值1.16，其 15%范围 为0.99-1.33内参实际应用情况2013年6-7月间，内参共检验124次，其中10次不符合要求，合格率92%（4/6）北京科兴甲肝体外相对效力检验FDA所列的生物分析方法之一举例说明表明：表明：甲肝体外内参设立标准严格于FDA法规要求目前的甲肝体

22、外效力检验系统是稳定、可靠目录 国际法规对生物分析方法验证的要求 双抗夹心ELISA检验方法实例和验证介绍 ELISA分析模型的选择双抗夹心ELISA抗原定量检测应用举例厂家检验项目最低检出限北京科兴质控部目前使用HBV核心抗原1ng/mlHCV核心抗原1ng/mlHIV p241ng/ml前列腺特异性抗原肺结核抗原幽门螺旋杆菌抗原卵清蛋白0.312ng/mlVero宿主细胞蛋白2ng/ml非限制性核酸内切酶0.2ng/ml不同ELISA试剂盒验证的变异系数SampleMean concentrationng/mLS t a n d a r d deviationCV(%)15.070.234

23、.6024.090.317.5533.280.267.8942.180.062.8351.590.0684.5960.780.0283.54 Intra-assay板内SampleMean concentrationng/mLS t a n d a r d deviationCV(%)18.830.738.2324.550.296.3533.040.217.0240.820.056.57 Inter-assay板间卵清蛋白的ELISA定量试剂盒幽门螺旋杆菌抗原不同ELISA试剂盒验证的变异系数POOlIntra assay CVInter assay CVLow6.9%4.4%Medium5.5%3.7%High3.5%3.6%Vero 宿主细胞蛋白不同的定量