保健食品中核苷酸的测定

1、保健食品中核苷酸的测定Determination of nucleotide in health food1 范围本方法规定了以液相色谱法测定保健食品中的核苷酸。本方法适用于作为功效成分添加于婴幼儿配方奶粉中核 苷酸的测定。本方法检出限：胞嘧啶核苷（CMP 0.04 卩 g/ mL、脲嘧啶 核苷（UMP 0.05 卩 g/ mL 腺嘌呤核苷（AMP 0.05 卩 g/ mL 鸟嘌呤核苷（GMP 0.06 卩 g/ mL 次黄嘌呤核苷（IMP） 0.04卩g/ mL。本方法线性范围：胞嘧啶核苷（ CMP 0.99212.4 卩 g/ mL脲嘧啶核苷（UMP1.1714.6 卩 g/ mL 腺嘌呤

2、核苷（AMP 1.01 12.6 卩 g/ mL、鸟嘌呤核苷（GMP 0.948 12.3 卩 g/ mL 次黄嘌呤核苷（IMP） 1.3016.3 卩 g/ mL。2 原理将试样溶解、去除蛋白后，使用氨基固相萃取柱对核苷酸进行净化富集，根据高效液相色谱紫外检测器在254nm 处的响应进行定性定量。3 试剂除非另有说明，在分析中仅使用确定为分析纯的试剂和双蒸水。3.1甲醇优级纯。3.2乙酸。3.3磷酸二氢钾。3.4磷酸氢二钾。3.5季铵盐固相萃取柱。3.6核苷酸标准储备溶液：准确称量经 100C,4h 干燥处 理的标准品胞嘧啶核苷（CMP 100mg,脲嘧啶核苷（UMP、 腺嘌呤核苷（AMP、

3、鸟嘌呤核苷（GMP、次黄嘌呤核苷（IMP） 各 40mg,加水定容至 100mL。3.7核苷酸标准使用液：将核苷酸标准储备溶液用0.25mol/L,pH=3 的磷酸二氢钾稀释 100 倍。4 仪器设备4.1高效液相色谱仪：附紫外检测器（UV）5 分析步骤5.1试样处理5.1.1准确称取 10g 试样于 100mL 容量瓶中，加入约 50C热水80mL,彻底混匀。当试样液达到室温后用水定容至刻度。5.1.2准确吸取 10mL 试样溶液至 100mL 容量瓶中，加入 0.5 %乙酸 5mL 水 10mL,混匀后静置 5min 以沉淀蛋白。 用 水定容至刻度，混匀后过滤，弃去数 mL 初滤液后收集约

4、 30mL 滤液。5.1.3将季铵盐固相萃取柱先用 10mL 甲醇、10mL 水活化后，再将 20mL 试样滤液过滤，以 1mL 水清洗萃取柱，用0.25mol/L,pH=3.5 磷酸二氢钾溶液洗脱出5mL 滤液。全部过程需要控制流速 1 滴/秒。5.2 液相色谱参考条件5.2.1色谱柱：C18 柱 3.9x150mm5.2.2柱温：25C。5.2.3 紫外检测器：检测波长254nm。5.2.4流动相： 0.01mol/L 磷酸二氢钾： O.1mol/L 磷酸氢二 钾=480:20。5.2.5流速：0.6mL/min。5.2.6进样量：10 此。5.2.7 色谱分析：量取 10 卩 L 标准溶

5、液及试样溶液注入色谱仪中，以保留时间定性，以试样峰高或峰面积与标准比较定量。5.2.8保留时间X =在上述色谱条件下，5 种核苷酸的保留时间见色谱图，浓度分别为胞嘧啶核苷（CMP 12.4 卩 g/mL,脲嘧啶核苷（UMP14.6 卩 g/mL、腺嘌呤核苷（AMP 16.3 卩 g/mL、鸟嘌呤核苷（GMP 12.6 卩 g/mL、次黄嘌呤核苷（IMP） 12.3 卩 g/mL。5.3 分别配制浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、16.0 卩 g/mL的 4 种核苷酸标准溶液，在给定的仪器条件下进行液相色谱 分析，以峰面积对浓度作标准曲线。1 分析结果表述6.1 计算h1C K 5 100h2m 1000式中：X - 试样中核苷酸的含量，mg/100g ;X =h1-试样峰高或峰面积;C-标准溶液浓度，g/mL ；K -稀释倍数；h2-标准溶液峰高或峰面积；m - 试样