多药耐药基因的临床意义与检测方法

1、多药耐药基因的临床意义与检测方法1MDR 概念肿瘤细胞耐药性可分为内在性耐药(intrin sic drug resista nee 和获得性 耐药(acquired drug resista nee 两类，既原发地存在于某些肿瘤中， 称内在性 耐药；继发于化疗后，称获得性耐药。根据耐药谱可分为原药耐药(primary drug resistance,PDR 和多药耐药(multidrug resistance,MDR)。PDR 只对诱导原药产生耐药，而对其它药物不 产生交叉耐药。 而 MDR 是一种药物诱发， 而同时对其它多种结构和作用机 制完全不同抗癌药物产生交叉耐药。内在性耐药原因仍不清

2、楚，而获得性 耐药是由于变异耐药肿瘤细胞亚群过渡生长所致。内在性耐药与获得性耐 药作为一种独特耐药现象是成功地治疗肿瘤关键性难题，因而成为近几年 国内外研究和探索热点。2MDR 耐药机制1970 年 Biedler 和 Riehm 首先描述了 MDR 表型：一种药物诱导产生耐 药细胞株可用对其它多种化学结构和功能完全不同化疗药物产生耐药。他 们发现对放线菌 D 耐药细胞，同时也对多种抗肿瘤抗生素如柔红霉素等， 以及结构与作用机制迥异植物碱类抗肿瘤药如长春新碱等交叉耐药。 1976 年，Julia no 等最先在耐药中国苍鼠卵巢细胞中发现一种新与耐药程度呈数 量关系高分子量细胞膜糖蛋白，命名为

3、P 糖蛋白(p-glycopratain,p-gp)。因其 分子量为 170kda,又名 pgp170，认为此蛋白可降低细胞膜对药物通透性而 引起耐药。后来又陆续研究发现在不同来源多药耐药细胞中这种P 糖蛋白分子量范围在 130180kda,主要集中在 150180kda,它由多药耐药基因 MDR编码。近十几年，国外已从耐药肿瘤细胞株中分离出耐药基因 MDR1 和它表达 P糖蛋白。1986 年 chen 等克隆了编码 P 糖蛋白 cDNA :2。2.1MDR 基因家族在哺乳动物， MDR 基因是一较小相对保守基因家族。 在人类基因组中， 它含有两个基因 MDR1 和 MDR2，在啮齿类由三个基

4、因组成： MDR1 , MD R2，MDR3。2.2MDR 基因基因图谱研究表明人类 MDR 两种基因定位于第 7 号染色体 q21.1 带 3 30kb中。含有 28 个外显子，28 个外显子序列与 cDNA 完全一致，cDNA 全长 4.5kb。在不同细胞系中 MDR1 启动子显示活性不同，其增加子活性亦 不同，因此 MDR1表达呈组织特异性。2.3MDR 基因表型MDR 基因表型是与其基因产物 P 糖蛋白有关。许多研究表明，MDR 表型表现为 MDR 基因过度表达伴有或不伴有基因扩增。 研究发现， 在耐药 程度低耐药细胞系，可无 MDR 基因扩增，只有 MDR 基因表达增加 （即 mR

5、NA 表达增加，P 糖蛋白功能增强）。此时低度耐药细胞 P 糖蛋白功能增加是 由于 mRNA 转录水平增高，而非基因拷贝增加所致。MDR 表型最突出特点是其编码 P 糖蛋白功能增加而导致产生了多药耐 药性。因此 P 糖蛋白是 MDR 基因表型标志。2.4P 糖蛋白MDR 基因编码 P 糖蛋白是分子量约为 170Kda 胞膜蛋白，由 1280 个氨 基酸组成，同源双链，每条链有 6 个跨膜疏水区，其构成三个跨膜孔有一 个细胞内核苷糖连接点可能与 ATP 连接并发生水解作用。通常认为，P 糖 蛋白具有一种能量依耐跨膜药物外输泵功能，当肿瘤细胞与抗癌药物接触 时，脂溶性药物浓度梯度进入细胞，而 P

6、糖蛋白则结合药物分子，同时其 A TP 结合位点连上 ATP, ATP水解后释放能量将药物从胞内泵出胞外，药物 在胞内浓度不断下降，其细胞毒作用因而减弱甚至丧失，出现耐药现象。人类 MDR1 和 MDR2 两种基因分别编码了两种结构相似,功能不同 P 糖蛋白，MDR1 和 MDR2 两种基因及其所编码两种 P 糖蛋白具有高度同源 性,其同源性达 80%,然而这两种基因产物表达却呈组织特异性而且有不 同生理功能。 MDR1表达产物可将亲脂类化疗药泵出细胞外,因而有耐药 特性； MDR2 表达产物则主要分布在骨骼肌纤维上,可将肌纤维代谢产物, 如激素等转运到膜外,无转运亲脂类药物功能,故不具多药耐

7、药性作用。然而在最近研究报告中这种基因仍然作为一个重要提示,即治疗前髓性白 血病 B 细胞出现高表达 1。3在正常组织及肿瘤组织中 MDR1 基因表达3.1在正常组织中 MDR1 基因表达认识 P 糖蛋白在体内正常表达进行和功能是重要。P 糖蛋白在正常人体 细胞内也有表达，表明 MDR 基因并非异常基因，P 糖蛋白并非是一种异常 蛋白，而且具有一定生理功能。了解 MDR1 基因在正常组织中表达，具有 三个作用。（1）为了建立一个肿瘤中 MDR1 表达增加基线。 （2）增加我们关于 正常 P-gp 生理功能知识。 （3）更好了解在缓解人类肿瘤耐药方面潜在作用。 正常组织中分为高、中、低三个表达水

8、平。肾上腺、肾脏高水平表达；肺、 肝、结肠、空肠、直肠中等表达；而皮肤、骨骼肌、心肌、脾、食道、胃、 卵巢、骨髓等则低表达或不表达。可以发现 MDR1 表达主要是在具有分泌 和排泄功能器官组织特殊上皮细胞中，其功能为降低有害外源性物质对细 胞损害，具有正常生理保护功能。维持血脑、血睾丸及血胎盘屏障（脑组织及睾丸组织血管内皮细胞、胎盘滋养叶细胞 MDR1 基因表达水平高 ）。已有 报道 MDR 基因及其产物在正常细胞防御中起着不可忽略作用， 尤其是对化 学致癌物及化学毒素防御 1， 7， 4。3.2在实体肿瘤中 MDR1 基因表达如前所述，肿瘤细胞多药耐药性分为内在性耐药与获得性耐药两类。 在肿

9、瘤细胞中，MDR1 表达与肿瘤细胞组织起源有关。 临床研究发现， 实 体肿瘤中 MDR1基因表达分四组：第一组癌症通常表达高水平 MDR1mRN A。大多数本组肿瘤正常组织中存在中间至高水平 P-gp 170 表达，如肾细 胞癌、结肠癌、肝细胞癌、肾上腺皮质癌、嗜络细胞瘤等。临床发现这些 肿瘤显示出对治疗不敏感性 （那就是说存在内在性耐药 ）。第二组所包括癌症 偶然表达高水平 MDR1mRNA（ 中间 MDR1 表达水平 ）、如神经母细胞瘤、 软 组织肉瘤、乳腺癌，本组肿瘤趋向比第一组治疗效果好，不幸是本组经过 化疗后常常得到获得性耐药。第三组所包括肿瘤罕见 MDR1mRNA 表达（几 乎所有

10、都没检测到或低 MDR1 表达）如卵巢癌、食道癌、wilms 瘤、膀胱癌、 肺癌等。本组肿瘤通常化疗治疗是有效，但许多肿瘤通过药物刺激将发展 为获得性耐药。第四组包括肿瘤经过化疗后 MDR1基因表达水平提高。3.3在恶性血液学方面检测 MDR1 基因表达许多血液失调病人在治疗过程中发展成为耐药。由此 MDR 概念产生 研究白血病病人耐药最大优势是不论治疗前与治疗后都很容易获得肿瘤标 本，且不受肿瘤大小、存在部位和血管血流等非耐药因素影响。因此与实 体肿瘤相比恶性血液病人 MDR1 表达数据是回归性且经过了化疗治疗。在正常血液细胞内 (全骨髓、 脾、纯净淋巴细胞 )发现低和非常低 MDR1 水平

11、表达。在几乎所有类型白血病、多发性骨髓瘤和非何杰金氏淋巴瘤不 论治疗或未经治疗病人都有 MDR1 水平增高报道， MDR1 水平可以在一个 由低到高范围甚至在未治疗病人中出现高水平表达。我们用非同位素原位 杂交方法检测正常人骨髓 MDR1mRNA 表达阳性率低于 10%，强度为弱阳 性。恶性血液病在 MDR1 表达方面可以分为三个不同组。 第一组 MDR1 水 平通常在未治疗前增高即内在性耐药肿瘤， 如 CML 在其复发期。 第二组为 未经治疗癌症病人 MDR1 水平偶尔提高，如成人急性淋巴性白血病 (ALL) 、 成人急性非淋巴细胞白血病 (ANLL) 、何杰金氏淋巴瘤。第三组，在有些癌 症

12、中经治疗复发时， MDR1 水平提高，包括 ALL 、ANLL 。在临床急性白血病研究中发现， MDRImRNA 阳性组缓解率(CR)，明 显低于 MDRImRNA 阴性组 CR,并且 MDRImRNA 阳性患者达到缓解而 需疗程较MDR1 阴性患者长。有文献报道 MDR1 基因表达阳性初治患者 C R 率为 27%60% :7,而 MDR1 基因表达阴性者 CR 率为 72%90%,说 明 MDR1 基因表达是导致诱导缓解失败主要原因。4MDR1 基因表达研究临床意义研究 MDR1 基因表达与临床化疗关系,是从分子水平而非细胞水平来 探讨肿瘤对化疗药物敏感性与耐受性,可用来预测病人对化疗反应

13、以及化 疗过程中疗效判断和监测预后,可望使肿瘤在更高水平上进行治疗和观察, 使化疗个体化,临床医生可根据每个病人 MDR1 表达水平判断耐药程度, 合理地制定化疗方案,具体来讲 2：(1)预测病人对化疗药物敏感性与耐 受性,有针对性地选择最有效药物,避免盲目用药,减少不必要毒副作用。(2) 化疗过程中,若 MDR1 表达逐渐增高,要注意获得性多药耐药性发生, 及时调整化疗方案。 (3)在未进行化疗前, MDR1 即显高表达,表示存在内 在性多药耐药性，可考虑使用 MDR 逆转剂配合抗癌药物化疗。 (4)预测肿 瘤复发、转移及预后。 (5)在研究中评价 MDR 逆转药物疗效。与 MDR1 基因相

14、关化疗药物包括 (1) 烷化剂类。 (2)植物碱类抗肿瘤药。(3) 抗肿瘤抗生素类。 (4)激素类等。通常为分子量大亲脂类化合物。与 MD R1基因无关化疗药物包括(1)抗代谢类药物，如 5-氟脲嘧啶等。(2)铂类化合 物如顺铂等 2， 5。由于 MDR 相关化疗药物包括了常用抗癌药绝大部分，可供 MDR1 高 表达病人选择使用抗癌药所剩无几。如何克服 ?目前研究方向之一是选择逆 转剂。所谓逆转剂机理是，逆转剂能与耐药细胞表面P 糖蛋白结合，竞争性抑制 P 糖蛋白与化疗药物结合，阻止化疗药物从细胞内流出，从而提高 细胞内化疗药物浓度，增强化疗效果。(图 1B)目前发现可逆转 MDR 药物包 括

15、(1)钙通道阻滞剂；如异博定。 (2)钙调蛋白拮抗剂：如环胞菌素 A 等。 (3) 抗心律失常药：如潘生丁，心得安等。目前主要用于临床是异博定 (VRP) 和环胞霉素 A(CSA) ，但都存在一定毒副作用。如果还存在其它耐药机制则 影响逆转效果。5MDR 检测方法 随着分子生物学发展，检测手段不断增加。目前主要从分子水平、蛋 白水平、细胞水平多途径展开了研究。5.1 分子水平 由于人肿瘤细胞几乎不存在 MDR1DNA 扩增，因此，无法 检测 DNA变化，主要是检测 MDR1mRNA 表达水平。常用方法包括： RT- PCR、原位杂交(ISH)、Slot-blot(SB)、Northern bl

16、ot(NB)、RNase 保护实验 等12。5.2 蛋白水平 免疫组织化学法(IHC)，免疫荧光等。常用 P-gp 特异性单 克隆抗体有 JSB-1、 MRK1 、 C219、 U12、 HYB-612 等，不同单抗识别不同 抗原决定簇，每种单抗特异性和亲合力不完全相同。5.3细胞水平 检测细胞药物输出功能，采用荧光染料如若丹明 -123 或具 有天然荧光柔红霉素与细胞共同培养后，用荧光分光度计测定单个细胞内 药物浓度，与对照组比较判定细胞耐药程度。最近国外使用流式细胞仪， 高分析技术(扫描激光和聚焦显微镜)等先进设备对 P-gp 进行功能检测。Pi wneca-Worns 等描述一个人造 r

17、 散射锝洛合物 hexakis 99MTC SESTAMI BI 对 P-gp170 进行功能图象分析。99MTC SESTAMIBI 是一脂性具有放 射性药物性阳离子其可被多药转移机制主动转导。这项技术通过有价值 r 散射性99MTC 进行 P-gp170 功能测试，是一个新颖快速测定人体内肿 瘤细胞 P-gp170 表达方法。以上各种方法，各有优缺点。综合评价： (1)敏感性， PCRISHPGP SB、NB 及细胞功能测定。(2)特异性，PCR、ISHPGPSB、NB 及细胞功 能测定2，12。目前 MDR1 基因检测强调标准实验重要性。要求标准实验为：既要有 足够灵敏性以检测小体积样本

18、中 MDR1 基因表达，并且能定量且能区别出 正常组织表达还是肿瘤组织表达。要想达到该标准，几种实验组合会给临 床提供更确切信息。且参与实验室须规范标准化报告及进行质量控制 1， 7。由于上面介绍这些检测技术不论是在灵敏性方面还是特异性方面都不 可避免地受到一因素限制。这些因素导致我们不论是对正常组织还是恶性 肿瘤组织 MDR方面检测都出现相互矛盾结果。 当然抗肿瘤药物耐药过程复 杂性，及一些外在其它因素如肿瘤组织变异，其它耐药机制存在和低水平 MDR 标志表达等因素都会导致一些相互矛盾结果。 还有以前治疗因素影响 MDR 表型及实验时间不适当等因素都会导致 MDR 表达与引起化疗困难结 果不

19、一致。要解决这些问题我们还有大量工作要做。作者单位：张真路 (430050 武汉市汉阳铁路中心医院病理科 ) 吴人亮 (同济医科大学病理教研室 )参考文献：1sglke van der Heyden.P-Glycoprotein:clinical significance and Met hodsof Analysis.CIinical Laboratory Scienee, 1995, 32(3): 221 2642柏珊，多药耐药基因与肿瘤化疗、白血病现代分型 .中国抗癌协会 肿瘤标志委员会, 1995, 89 923苏慧慈,原位杂交 .北京:中国技术出版社, 1994, 592294Cor

20、don-Cardo,et al.Expression of Multidrug Resistance Gene Product(P-Glycoprotein)in Human Normal and Tumor Tissuse.The Journeal ofHistochemistry a nd Cytochemistry, 1990, 38(9): 1277 12875K Nooter,et al Multidrug resistance(mdr)genesin human cancer.Br JCancer, 1991,63, 663 6696Kayuga Endo,et al Multid

21、rug Resistance-AssociatedProtein Express ionin Clinical Gastric Carcinoma CANCER,1996,77: 168116877Robert J Arceit.Clinical Significance of P-Glycoprotein in Multidr ugResistance Malignacies Blood,1993,81: 221522228FoJo,et al.Expression of a multidrug gene in human tumor and tissues.Medical Science,

22、1987,84:265 2699 JEAE-PIERRE MARIE , et al Multidrug Resistance(MDR)Gene E xpressionin Acute Non Lymphoblastic Leukemia:Sequential Analysis.Leuk emia andLymphoma, 1992,8:262 26510Hiroshi Kanamaru,et al MDR1 RNA Levels in Human Renal Cel lCarcinomas:Correlation With Grade and Prediction of Reversal o

23、f Doxor ubicinResistance by Quinidine in Tumor Explants.Joumal of the National CancerInstitute, 1989, 81(11)11Kazuya Endo,et al.Multidrug Resistance-AssociatedProtei n Expression in Clinical Gastric Carcinoma.CANCER Supplement 1996,77: 16811 68712N.A.Brophy,et al.Mdrl Gene Expression in Childhood Ac

24、ute Lymphoblastic Leukemias and Lymphomas:A Critical Evaluation by Four Techniques.LEUKEMIA.1994 , 2: 327 33513PRAMILA RAMANI , et al.EXPRESSION OF mdr1/P-GLYCOPROTEIN AND p110 IN NEUROBLASTOMA.JOURNAL OF PATHOLOGY,1995,175: 13 2214Daniel.Multidrug Resistance(MDR1)in Leukemia:Is it Time to Test?Bloo

25、d, 1992,295 29815William T.Beck Multidrug Resistance and its Circumvmtion.EUr JCancer, 1990,26(4): 51351516Shinn-Liang Lai,et al.MDR1 Gene Expression in Lung Cancer.J o f theNational Cancer Inst 1989,181(15): 11441150 17 R.BROWN GENE AMPLIFICATION AND DRUG RESISTANCE. J ofPathol, 1991,163,28729218Je

26、an Bourhis,et al.Correlation of MDR1 Gene Expression With Chemotherapy in Neuroblastoma.J Natl Cancer Inst, 1989,81(18): 140114 0519Jean-PierreMarie,et al Multidrug Resistance(mdr1) Gene Expressio n inAdult Acute Leukemias:Correlation With Treatrnent Outcome and In Vitro DrugSensitivity.Blood,1991,7

27、8(3): 58659220Goldstein et al.Expression of a Multidrug Resistance Gene in Hu manCancers.J Natl Cancer Inst, 1989,81:11612421Ding-Wu Shen,et al.In Situ Hybridization Analysis of Acquistition andLoss of the Human Multidrug-Resistance Gene.CANCER RESEASE,1988,48:4334433922Kathleen W,et al.Afplificatio

28、n and Expression of Genes Associate d andExpression of Genes Associated with Multidrug Resistance in Mam malianCells.SCIENCE,1986,232:75175423Bethesda.Clinical Trials of Agents That Reverse Multidrug-Resistance.J Clinical Oncology, 1989,7:40941124Rik J.Scheper.Overexpressionof a Mr 110,000 Vesicular

29、 Protein i nNon-P-Glycoprotein-mediated Multidrug Resistance.CNCER RESRARC H, 1993,53:1 475 147925D.Russo,et al.Coexpression of Anionic Glutathione-S-Transferase(GSTn)and Multidrug Resistance(mdrl) Genes in Acute Myeloid and Lymp hoidLeukemias.LEUKEMIA,1994,8:881 88426Akira Nakagawara, et al.Inverse Correlation between Expression ofMultidrug Resistance Gene and N-myc Oncogene in Human