研究生课质粒dna的提取与酶切鉴定

1、汪建成汪建成 生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室干细胞与组织工程中心干细胞与组织工程中心实验内容质粒质粒DNADNA提取提取质粒的酶切与鉴定质粒的酶切与鉴定（电泳检测下次进行）（电泳检测下次进行）实验目的掌握质粒提纯的原理和方法掌握质粒提纯的原理和方法; ;掌握核酸内切酶切割质粒的原理掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切酶并学会运用内切酶. .DNADNA克隆技术操作过程：克隆技术操作过程： 重组重组DNADNA技术技术/ /分子克隆分子克隆/DNA/DNA克隆技术克隆技术/ /基因工程基因工程DNA克隆技术示意图克隆技术示意图 载体DNA(限制性内切酶切开)目的基因宿

2、主细胞重组体已转化的宿主细胞阳性克隆株繁殖表达重组重组DNADNA技术的一般过程技术的一般过程2. 2.目的基因目的基因 和质粒载体和质粒载体 的连接的连接 3. 3.将重组将重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞 4. 4.选择选择5. 5.目的基因表达目的基因表达 1. 1.目的基因的获取目的基因的获取基因载体（gene vector）(1)质粒的定义 质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复制的一类双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋(supercoiled)形式存在。 1-200kb(2)(2)质粒的三种构型质粒的三种构型 超螺旋超螺旋DNA(SC DNA

3、)DNA(SC DNA) 开环开环DNA(OC DNA) 线状线状DNA(L DNA)(3)(3)质粒的拷贝数质粒的拷贝数高拷贝数的质粒称为松弛型质粒(relaxed plasmid)，独立于细菌细胞而自主复制；低拷贝数的质粒一般是严紧型质粒(stringent plasmid)，它们的复制随细菌染色体的复制同步进行。第第1 1个字母：（小写）个字母：（小写）p p代表代表plasmidplasmid；第第2 2，3 3个字母：（大写）代表人名、实验室名、表型性状或其他特征的个字母：（大写）代表人名、实验室名、表型性状或其他特征的英文缩写；英文缩写；编号：（阿拉伯数字）区别同一类型的不同质粒编

4、号：（阿拉伯数字）区别同一类型的不同质粒(4)(4)质粒的命名质粒的命名(5)(5)质粒的发展质粒的发展分离纯化质粒DNA 的三个主要步骤培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择）细菌的收集与裂解 收集高速离心的方法质粒DNA的提取纯化 （SDS-碱裂解法） 所有提取纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状的性质。实验原理在有在有EDTAEDTA及去污剂（及去污剂（SDSSDS）存在的条件下，用碱处理细菌，可以使细菌的）存在的条件下，用碱处理细菌，可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNADNA、质粒、质粒DNADNA、蛋白质和、蛋白质和

5、RNARNA等）；等）；处理过程中，染色体处理过程中，染色体DNADNA断裂成不同长度的双链断裂成不同长度的双链DNADNA。强碱环境（强碱环境（pH12.0-12.5）时：宿主菌的线性双链）时：宿主菌的线性双链DNA片段中的氢键断裂，片段中的氢键断裂，双链解离变性，而质粒双链解离变性，而质粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离；共价闭合环状的双链并不完全分离；当加入高浓度酸性盐，当加入高浓度酸性盐，pH值恢复至中性时：变性的染色体值恢复至中性时：变性的染色体DNA与变性与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒D

6、NA又恢复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心可以把染色体又恢复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心可以把染色体DNA、蛋白质蛋白质-SDS复合物等一起除去。复合物等一起除去。如果要提高如果要提高DNA的纯度，则可以用的纯度，则可以用RNA酶消化除去酶消化除去RNA，并用酚抽提法，并用酚抽提法除去残留的蛋白质。除去残留的蛋白质。实验主要试剂3.Tris3.TrisClCl能使溶菌液维持溶菌作用的最适能使溶菌液维持溶菌作用的最适PHPH范围范围( (缓冲作用缓冲作用) )实验主要试剂实验主要试剂变性的蛋白质与变性的蛋白质与SDSSDS和和K+K+形成的复合物也形形成的复合物也形成沉淀；成

7、沉淀；小分子的质粒小分子的质粒DNADNA却呈天然构型，能溶解在却呈天然构型，能溶解在bufferbuffer中；中； 通过离心可以把线粒体通过离心可以把线粒体DNADNA、不稳定的大分子、不稳定的大分子RNARNA、蛋白质蛋白质-SDS-SDS复合物等一起除去复合物等一起除去实验步骤：加加1ml1ml培养物于培养物于EPEP管，管，12000rpm12000rpm30s30s（重复一次）（重复一次） 去上清（除净），加入去上清（除净），加入100ul 100ul 溶液溶液I I，充分重悬，充分重悬加入加入200ul 200ul 溶液溶液IIII，立即、轻柔振荡数次，立即、轻柔振荡数次加入加入

8、150ul 150ul 冰溶液冰溶液IIIIII，震荡，震荡10s10s，冰浴，冰浴35min35min，12000rpm12000rpm10min10min注意事项：注意事项： 1、加样枪正确使用；、加样枪正确使用； 2、废液倒在水池中，枪头、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中；扔到垃圾桶中； 3、加不同溶液要换枪头；、加不同溶液要换枪头； 4、离心前把管擦干；、离心前把管擦干； 5、转移上清时不要吸到沉、转移上清时不要吸到沉淀；淀； 6、吸取酚时枪头伸到下层、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到溶液中，注意不要沾到 皮肤。皮肤。实验二限制性内切酶切割重组质粒（双酶切）限制性核酸内切酶定义

9、能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的磷酸二酯键断裂,产生相应的限制性DNA片段。主要存在于细菌体内。分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第四个字母代表细菌的特定菌株，用大写或小写；第四个字母代表细菌的特定菌株，用大写或小写；（有时无）（有时无）用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名Hin d 属属 种种 株株 序序Haemophilus influenzae d株

10、株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶型限制性内切酶的共性与特性型限制性内切酶的共性与特性类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)(palindrome)切口切口 ：平端切口、粘端切口：平端切口、粘端切口反向重复序列Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口实验原理利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒DNA） 重组质粒; BamHI 、H

11、ind 限制性内切酶;反应缓冲液;琼脂糖凝胶电泳所需试剂和设备实验材料重组质粒重组质粒BamHIHind III双酶切双酶切电泳检测电泳检测5-GAATTC-33-CTTAAG-5BamHI5-AAGCTT-33-TTCGAA-5Hind III 质粒DNA 10l 10M buffer 2l BamH 1l Hind 1l ddH2O 6l 合计合计20l准备室准备室老师已老师已加好加好同学自同学自己加己加加完轻吹数次混匀，加完轻吹数次混匀，37，1-3h双酶切反应体系实验操作酶切反应液（包含酶切反应液（包含BamH I, Hind III, Buffer, BamH I, Hind III

12、, Buffer, H2O H2O ）已由准备实验的老师配好）已由准备实验的老师配好每人一份，每份每人一份，每份10ul10ul将酶切底物（质粒）与反应液混合将酶切底物（质粒）与反应液混合充分混匀，瞬时离心充分混匀，瞬时离心3737C C，1-31-3小时小时电泳检测（下次进行，请回收酶切前后的质粒）电泳检测（下次进行，请回收酶切前后的质粒）载体构建总论 载体构建的基本流程 载体的特征、分类与选择 酶切连接 同源重组 重组质粒的表达1.载体构建的基本流程目的基因片段的获取重组质粒的构建重组质粒的筛选与验证重组质粒的表达酶切连接同源重组目的片段获取前先根据实验目的选择相应的载体类型，构建方法、筛

13、选方法等2.载体的四个主要特征多克隆位点 复制起始位点遗传标记基因载体大小3.载体的分类（一）按来源：1.质粒载体：多使用大肠杆菌质粒为载体。2.噬菌体载体：多是感染大肠杆菌的噬菌体。3.病毒载体：多用于真核生物。（二）按功能：1.克隆载体：可插入外源基因，酶切位点多。2.表达载体：用于外源基因的表达（原核和真核）。（三）按进入受体细胞类型：1.原核载体。2.真核载体。3.穿梭载体：穿梭往返两种生物之间。4.质粒载体选择的三点思考【1】构建DNA重组体的目的克隆扩增/基因表达？【2】质粒载体的类型真核/原核？【3】质粒载体的具体图谱信息大小/启动子/MCS/抗性特征?质粒基本特征的认识酶切位点

14、酶切位点酶切位点酶切位点启动子启动子质粒大小质粒大小原核抗性原核抗性多克隆位点多克隆位点复制起始点复制起始点阅读质粒图谱的四步法第一步：首先看Ori的位置及类型，了解质粒的类型。（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。（Amp水解内酰胺环，解除氨苄的毒性。）第三步：看多克隆位点（MCS），决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。（1）应具有多个限制酶的单一切点。（2）便于外源基因的插入。（3）如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。（抗性筛选、蓝白斑筛选）PS：看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DN

15、A片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第四步：是否含有其他元件：标签蛋白元件、表达系统元件，即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。复制起点（Origin of replication）质粒的筛选标记抗性基因的筛选1、菌的筛选标记Amp(氨苄霉素)Kana(卡那霉素)Tet (四环素)Cm (氯霉素) 2、真核表达的筛选标记Neo (新霉素，G418)Puro（嘌呤霉素）Hygro(潮霉素)Zeo(博来霉素)案例分析标记蛋白的筛选是否是融合蛋白是否会影响蛋白构象 红色荧光和绿色荧光质粒的多克隆位点克隆位点的筛选1）：基因片段与片段连接片段A片段B2）：基因

16、片段与载体连接载体片段A1、A/B上都没有2、A没有，载体上有真核生物的基因结构启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号(1)启动子:促进DNA 转录的DNA 序列,这个DNA 区域常在基因或操纵子编码序列的上游,是DNA 分子上可以与RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。（lac、trp、T7）(2)核糖体结合位点:mRNA 有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG(起始密码)和SD 序列。(3)转录终止序列:转录终止序列有助于使RNApol重点转录克隆的外源基因，控制所转录RNA的长度，提高RNA的稳定性。重点思考题1：基因工程中有克隆载体和表达载体，克隆

17、载体可以在受体菌中大量复制，表达载体用于表达目的蛋白，那么实际应用中，我们的最终目的是要得到目的蛋白，克隆载体不能完成表达，有何用呢？参考解释：参考解释：克隆的目的比较单一，就是将你感兴趣的克隆的目的比较单一，就是将你感兴趣的DNADNA片段片段重组进入载体，然后在宿主细胞中大量繁殖，主要重组进入载体，然后在宿主细胞中大量繁殖，主要用于各种文库的建立，比如人类基因组计划；同时用于各种文库的建立，比如人类基因组计划；同时由于载体所能容纳的目的片段的长度是有限的，而由于载体所能容纳的目的片段的长度是有限的，而克隆载体没有表达所需的各种片段，所以可以容纳克隆载体没有表达所需的各种片段，所以可以容纳更

18、长的目的片段，即可以克隆足够长的基因，效率更长的目的片段，即可以克隆足够长的基因，效率更高。更高。重点思考题2：实际工作中，构建兼有克隆和表达双重功能的载体有何困难？参考解释：参考解释： 表达载体的目的是多样化的，由于实际工作的需要，不同的实表达载体的目的是多样化的，由于实际工作的需要，不同的实验目的就需要设计不同的载体，用表达载体克隆基因不是不可以，验目的就需要设计不同的载体，用表达载体克隆基因不是不可以，实际工作重要考虑许多因素，因此更复杂。实际工作重要考虑许多因素，因此更复杂。 例如：细菌摄取能量的能力是一定的，如果用来合成大量蛋白例如：细菌摄取能量的能力是一定的，如果用来合成大量蛋白质

19、，合成核酸就会相应减少。另一方面，细菌承受的工作负荷也质，合成核酸就会相应减少。另一方面，细菌承受的工作负荷也是有限的。是有限的。 综上：完全可以构建双重功能的载体，但是相对效率会低很多。综上：完全可以构建双重功能的载体，但是相对效率会低很多。因此，我们一般的策略是：将目的片段克隆到非常因此，我们一般的策略是：将目的片段克隆到非常简单的克隆载体上，按照需要再克隆到可以满足各简单的克隆载体上，按照需要再克隆到可以满足各种要求的表达载体上。种要求的表达载体上。重点思考题3：请回答一下基本信息。载体类别载体类别哺乳动物哺乳动物表达载体表达载体细菌抗性Amp宿主大肠杆菌、哺乳动物细胞真核启动子CMV、

20、SV40原核启动子T7、bla细胞筛选标记新霉素原核复制起点f1、pUC真核复制起点SV40高拷贝测序bla重点思考题4：请分析下列质粒测序结果。参考解释：参考解释：5.酶切连接TATA克隆克隆重点思考题5：如何理解以下句子：“TA克隆载体可以直接克隆PCR产物，省去了两端加装识别位点的设计，PCR效率就更高。”参考解释：参考解释：PCRPCR产物可以直接接入产物可以直接接入T T载体，而经典的克载体，而经典的克隆隆PCRPCR产物需要限制性内切酶切割后接入载体，设计产物需要限制性内切酶切割后接入载体，设计PCRPCR引物需要两端加酶切位点，因此这部分序列与模引物需要两端加酶切位点，因此这部分序列与模版不配对，自然版不配对，自然PCRPCR效率就低了。效率就低了。PSPS：如果：如果PCRPCR产物设计了酶切位点就可以直接克隆进产物设计了酶切位点就可以直接克隆进需要的载体，不必借助需要的载体，不必借助T T载体。因为高保真酶通常不产载体。因为高保真酶通常不产生生A A碱基，所以如果片段较长时，必须使用高保真酶，碱基，所以如果片段较长时，必须使用高保真酶，那么就不能使用那么就不能使用T T载，而需要设计酶切位点。载，而需要设计酶切位点。 转化与转染转化：将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性。转染：将含有目的gene的载体转到真核cell内。传统