高致病性PRRSV双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制及基因工程疫苗的研究

1、高致病性PRRS双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制及基因工程疫苗的研究猪繁殖与呼吸综合征是目前危害全球养猪业最严重的病毒性传染病之一。自1987年首次在美国出现以来,一直是世界养猪业防控的难题。而在我国自2006年6月份以来高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒在湖北、湖南、江西、安徽等地的出现和流行更是给我国养猪业造成了难以估量的损失。准确、可靠的检测技术和安全、高效的疫苗是预防和控制PRRS勺关键，也是目前猪病研究的热点。本文用原核表达系统对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF理因进行高效可溶性表达,并制备了抗猪繁殖与呼吸综合征N蛋白单克隆抗体,以该单克隆抗体作为包被抗体建立了双抗体夹心ELISA检测

2、方法,并进行了ELISA试剂盒的研制以期建立一套准确、可靠、方便、快捷的检测技术。另外,本研究还构建了分别以伪狂犬病毒和杆状病毒为载体的基因工程疫苗,并对疫苗的免疫效力进行了研究。1、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7S因的克隆及其在大肠杆菌中的表达根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）WUH1的核甘酸序列设计特异性引物，经RT-PCRJ法扩增获得编码核衣壳蛋白（N）的ORFS因,将ORF现因克隆至pGEM-T?asy载体上，获得含有ORF理因的阳性重组质粒pGEM-T-N经测序证实无碱基误配后，再将ORF理因亚克隆至原核表达载体pET-30a中，获得重组表达质粒pET-30a-N,转化E.co

3、liBL21（DE3）细胞,IPTG诱导后N蛋白得到表达，经SDS-PAG电泳和WesternBlotting检测证实N蛋白在大肠杆菌中主要以可溶性形式表达，并能与PRRSVG体阳性猪血清反应，具有很好的免疫学活性。2、抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的制备以纯化后的猪繁殖与呼吸综合征病毒WUH株ORF现因的原核表达产物免疫Balb/c小鼠，将SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞融合。分别使用重组N蛋白和由Marc-145细胞扩增的猪繁殖与呼吸综合征病毒作为抗原建立间接ELISA方法进行双重筛选，通过有限稀释法进行克隆。最后发现N3H1刖N4D2价显着高于其它杂交瘤细胞株，故将N3H1刖N

4、4D2用于后续研究。将N3H1牙口N4D2两株细胞分别接种Balb/c小鼠，制备腹水，结果腹水抗体的的效价分别为100X214和100X215。3、猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立及其应用以由Marc-145细胞扩增的PRRSVWUH1CH-1a株和Marc-145细胞分别作为抗原,以两株纯化的单抗互为包被抗体和酶标记物进行双抗夹心ELISA检测,结果以单抗N4D2t作为包被抗体、辣根过氧化物酶标记的单抗N3H1琳作为酶标记物的结果明显优于以单抗N3H1琳作为包被抗体、辣根过氧化物酶标记的单抗N4D纳作为酶标记物的检测结果。通过方阵滴定确定单抗的最佳包被浓度为21仙

5、g/mL,酶标记物的最佳工作浓度为1:1000。试验的最佳反应条件为：28c包被14h,37c封闭1h,抗原与包被单抗37c作用1h,酶标记物与抗原的最佳反应时间为371h,底物的最佳反应时间为15min。建立了双抗体夹心ELISA诊断方法，并对其进行了敏感性、特异性、重复性试验。敏感性试验的结果为该方法对重组N蛋白的最低检测量可达6.8ng,对PRRSV的最低检测量约为150TCID50,而RT-PCR式齐1J盒对PRRSVJ最低检测量约为20TCID50,说明该方法具有良好的敏感性；特异性试验表明除了阳性对照外，其它几种病毒和阴性样品检测均为阴性：重复性试验表明该方法的批间重复性和批内重复

6、性都很好；用猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原检测试剂盒和RT-PCR佥测试剂盒检测127份临床采集的血清样品,两种试剂盒的阳性符合率为84.6%,阴性符合率为86.4%,总符合率为85.8%。4、伪狂犬病毒为载体的PRRS厘组基因工程疫苗的研究在原有重组病毒rPRV-GP5m-M供表达GP5浒口M）的gG位点插入高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒WUH株的主要免疫原性基因ORF刎猪圆环病毒2型（PCV-2）修饰型ORF2（ORF2ml因的表达盒即CMV-ORF5-polyAF口CMV-ORF2m-poly构建重组病毒rPRV-PRRSV-2另外在重组病毒rPRV-GP5m-M表达GP5话口M）

7、的gG位点插入CMV-SynORF5-polyA达优化后的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF51因）,CMV-ORF4-polyA（表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒WUH株ORF41因）和CMV-ORF5-ORF2m-polyAJ（合表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒WUH的ORF51因和猪圆环病毒2型（PCV-2）修饰型ORF2（ORF2m烷达盒构建重组病毒rPRV-PRRSV-3Westernblot表明,外源目的基因均能正确的表达。小鼠动物实验证实,rPRV-PRRSV-2rPRV-PRRSV-3均能诱发免疫动物产生与亲本株rPRV-GP5m-M相当的特异性抗PRM体，并观察到诱发

8、不同程度的特异性抗PRRS的免疫应答，其中rPRV-PRRSV-3够诱发更高的中和抗体水平和细胞免疫水平。5、杆状病毒表达系统介导的PRRSVI因工程疫苗研究由于杆状病毒不能在哺乳动物细胞内复制,对哺乳动物来说非常安全,所以可以用来作为将外源基因投送到体内的载体。本研究利用VSV-G修饰过的杆状病毒作为载体，消除了杆状病毒的补体敏感性。在转移载体pFast-VSV-G下游插入分别由CMVI动子驱动的编码PRRSVORF3（截去疏水区2-64aa）、ORF4ORF5修饰后）、ORF61因，构建重组质粒pFast-CMV-ORF3456然后将重组质粒转化DH10Ba速受态细胞获得重组穿梭载体Bacmid-CMV-ORF3456g取Bacmid的基因组并经脂质体介导转染sf