提取d和r原理方法

1、主讲人：唐维（修改）:DNA诅:DNA、-一-口:RNA:RNA核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息，是生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是生物学实验技术中最重要、最基本的操作。:DNA诅:DNA、-一-口:RNA:RNAT心心W咚1D组DNA的提取>>>CTAB法SDS法其它D组DNA的提取非质粒DNA的提取·碱裂解法 煮沸法户线粒体、叶绿体DNA的提取户·差速离心结合SDS裂解法 DCTAB法（植物DNA提取经典方法）原理CTABChexadecyltrim ethylammon iu m bromide,十六烧基三甲基淏化物。铣）， 是一种阳离

2、子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合>>具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里溶液中 C>0.7mol/L NaCl )该复合物在是可溶的，通过抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15°C 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15°C。CTAB提取缓冲液的经典配方DTris-HCICp HS.O)提供一个缓冲环境，防 止核酸被破坏；EDTA赘合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供

3、一个环境，使DNP白 ）。CTAB溶解细胞膜，C脱氧核糖并结合核酸，使核酸便于分离；J3-硫基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醒，避免褐变，使酚容易去除组份Tris-HCI C pHS.O)EDTA C pHS.O)NaClCTABP-琉基乙醇终浓度100mM20m M1.4M2%(WN)0.1% CV/V)使用前加入T心心W咚1DCTAB提取缓冲液的改进配方Tris-HCIEDTACpHS.O)P-琉基乙醇NaClCTABPVP40组份CpHS.O)，2 %CV/V )终浓度100mM2 0 m M1.4M3%(W/V)5%(W/V)使用前加入'! PVP( 聚乙烯咄咯烧酮）是酚的

4、络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。PVP(PVP按其平均量大小分为四级，习惯上常以K值表示，不同的K值分别代表相应的PVP平均分子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物量有关的物理量，因此可以用K值来表征PVP的平均量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。在研磨过程中加入PY_P,强的 合多酚的能力，从其中的CO-N=基有很l同时向抽提液中加入还原剂P磕 基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。、丿HnNHT心心W咚1DCTAB法流程图植物材

5、料抽提DNA溶液上层溶液iiiiii液前刀牛裂D>-SDS法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温( 5565°C )条件下能裂解细胞，使离析，蛋白变性，出核酸；>(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴）， 使蛋白质及多糖提杂质沉淀，离心后除去沉淀；>上清液中的DNA用酚I 氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。DSDS法DNA提取缓冲液组份Tris-HCI C p H8.0)EDTA( p H 8.0)NaClSDS终浓度1 0 m M20 m M0.4M2%3. 2. 2改良的 SDS 法SDS 提取缓冲液稍有变化，具SDS, Tris- HCl( p

6、H 8秒5) 100、EDTA( pH体配制如下： 2%,8.0) 20、NaCl 100 mmol/ L . 3%PVP ( 聚乙烯毗咯烧酮），0. 1 %偏重亚硫酸钠，充分混匀。用此改进的SDS 法简2.65 水浴 60min, 其间缓慢摇动几次。3加 入150ul 的5mol/ LKac, 混匀，冰浴15min 左右DSDS法流程图（以动物组织为例）<_抽>提动物组织上层溶液DNA溶液细胞裂解iiiiii丿D根据细胞裂解方式的不同有：>>>物理方式：珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氧酸呱法、碱裂解法生物方式：酶法它匕D>根据核酸分离纯化方式

7、的不同有：吸附材料结合法：I硅质材料低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。 阴离子交换树脂I 低盐高pH值结合核酸，适用于纯度要求高的实验。低pH值洗脱。 磁珠I 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。>浓盐法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离>抽提法：作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用>密度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物它D碱裂解法原理>DNA比质粒DNADNA为线状分大得多，且子，而质粒DNA为共价闭合环状；>当用碱处理DNA溶液时，线状DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中

8、性pH时即恢复其天然构象；DN>变性段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA从而可通过离心将两者则以溶解状态存在液相中，。T心心W咚1D碱裂解法流程图/对数期菌体上清液沉淀抽提质粒DNA溶液离心洗涤、iiiiiiii及作用（乡一罚“ 四溶液 I50mM 葡萄糖 /1OmM EDTA / 25mM Tris-HCI,pH=8.0 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活 性。这一步溶液中还可以加入RNase, 后续步骤中被除去不受EDTA影响，并且可以在0.2M NaOH / 1% SOS 破细胞的主要是碱，而溶液II不是SOS

9、 ,所以才叫碱法抽提。溶液Ill3M 醋酸钾 / 2M 醋酸这一步的K置换了sos ( 十二烧基磺酸钠）中的Na,得C十二烧基磺酸钾）沉淀； sos易与蛋臼质结合，到PDS平均两个氨基酸上结合一个sos，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同组DNA也被PDS共沉淀时D煮沸法原理DNA比质粒DNADNA为线状分>大得多，且子，而质粒DNA为共价闭合环状；>当加热处理DNA溶液时，线状DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；DN>变性段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA从而可通过离心将两者则以溶解状态存

10、在液相中，。线粒体和叶绿体是生物体内半性细胞器，自身可编码蛋臼，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这种组分分级分离出来。，常用不同转速的离心法，将细胞内各D差速离心法原理>是利用物质比重的不同分离混合物的法。>将待分离物质置于均匀介质（庶糖）中，以一定的转速进行离心，比的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。:DNA诅:DNA、-一-口:RNA:RNAI. 材料准备!I I. 破碎细胞或包膜内容物I I I.核酸分离、纯化几IV. 沉淀或吸附核酸，并去除杂质V. 核酸溶解在适量缓冲液或水中组DNA的提取 质粒DNA的提取 >>最好使

11、用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）>>组DNA时，要提取血液培养时应加入筛选，否则选择有核细胞（白细胞）菌体易污染，质粒易丢失>>组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解尽量选择高拷贝的质粒， 如为低拷贝或大质粒， 则应加大菌体用量>的液体材料DNA含量较含> 少，提取前先富集菌株不要频繁转接（质粒丢失）按照性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞一次时，2个质粒；停止后仍然一次，每个细胞内只有1质粒也另一类是松弛型质粒，当，每一个细胞内一般有20个左右质能继续粒。一般量较大的质粒属

12、严紧型。鼠较小的质粒属松弛型。质粒的有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。属严T心心W咚1 组DNA的提取 质粒DNA的提取 >>>材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低菌体量适当培养基去除干净， 同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮>不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料液氮研磨>变性的时间不要过长否则质粒易被打断( 5 分钟），动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁>复性时间也不宜过长，否则会有组DNA的污染酵母破壁酶或珠>,G 十菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破

13、壁>高浴时， 定时轻柔振荡、-质粒DNA的提取>采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系>采用有机（酚氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔>离心分离两， 应保证一定的转速和时间（称大提，10000 转20min )>不同材料的特点， 在提取过程中辅以相应的去杂质的方法、-D 蛋白质的去除：>酚氯仿抽提>使用变性剂变性( SDS、异硫氝酸呱等）>洗涤>蛋白酶处理、-D 多糖的去除：法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/ 2体>积的5M NaCl,可溶解多糖。>用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯

14、(1/ 2体积），氯苯可>以与多糖的胫基作用，从而去除多糖。用PEGsooo代替乙醇沉淀DNA:在500µMNaCl)L,DNA液中加入冰浴20mi n。>200 µ 120%PEG80 (含1. 2、-D 多酚的去除：>在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：(3 - 琉基乙醇、坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇），它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合>D 盐离子的去除：70 %的乙醇洗涤 组DNA的提取质粒DNA的提取>>当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉

15、淀时加入1/10体积的NaAc充分沉淀( pHS.2,3M ),有利于>>>沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等隙干DNA,让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能赘和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0,可防止DNA发生酸解、D问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质重新纯化DNA,去除蛋1 .1.臼、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）DNA在溶解前，有酒2.重新沉淀DNA,充分挥发让精残留，后续酶解反应抑制2.DNA中残留有金属离子增加70 % 乙醇洗涤的3 .3.(

16、2- 3次）次数D问题二：DNA降解。尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融1 .材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融1.液氮研磨或匀浆组织后，前加入裂解缓冲液解冻2.2.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中赘合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融3.3.4.5.4.5.6.l对 策T心心W咚1D问题三：DNA提取量少。尽量选用新鲜（料）的材1.G+动植物要匀浆研磨充分；2.实验材料不佳或量少菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式

17、破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾侄1.破壁或裂解不充分2.3.沉淀全3.洗涤时DNA丢失4.4.5.6.l对 策1.CTAB配方如上，配制好备用，65度水浴预热。称叶片或果实采取后最好立即放到液氮中，避免酚类物质氧化2.65°水浴一个小时3氯 仿：乙醇：异戊醇=80:16:4的抽提液两次。10000转分离状物心20分钟，尽量把丝状物压紧，避免吸取上清时有丝牵拉 等体积预冷的异丙醇 ，75%乙醇洗去其他杂质。洗两次。用无水乙醇5毫升洗一次。隙干5分钟挥发掉乙醇后加入3-5mlT

18、E溶解，加入Sul,1mg/ml的RNA酶后保存组DNA称T心心W咚11- .Ti币 目玉打).+.:.·免;t,U行下1:令 吐？正亢IL 舅灯9. 对10. MM-410l臧？8勹rJ6:DNA诅:DNA、-一口:RNA坦:RNAD>异硫氝酸胀苯酚法原理：细胞在变性剂异硫氮酸肌的作用下被裂解，同时白体上的蛋白变性，核酸；出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整系中的中间相和水相，从而得以分离；抽提，沉淀，得到纯净RNA。D>异硫氝酸胀苯酚法步骤：材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氮酸抓（亚硫氢抓，琉基乙醇，N-月桂肌RNA,氨酸等）。使细胞及白复合

19、物变性，有效抑制核酸酶。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚氯仿可抽提去除杂物。洗涤： 70 %乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠 ( pH4.0):维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化捚选择沉淀RNA。D>>材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRi zol 或样品贮存液中，70°C或20°C保存>>如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，70°C短期保存D>样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般

20、TRi zo l 可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻>>样品量适当，保证充解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量D>>纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如沉淀等，虽然，但操作时间长，Li ClRNA降解；易造成>RNA后续酶反柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响应的杂质，是目前较为理想的选择。:DNA诅:DNA、-一-口:RNART-PCR常旧:RNADRNA 的降解I0D280 比值偏低0 D 2 6 0DD电泳带型异常D

21、下游实验效果不佳D新鲜细胞或组织：>裂解液的质量>外源RNase的污染裂解液的用量不足>>>组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品（如脾脏，胸腺等），很难避免RNA的降解。建议在液氮条件下将组织辗碎，并且匀浆时使用更多裂解液。D冷冻样品：>样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至- 70°C冰箱保存。样品要相对小一点；>先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；>样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，辗磨过程中及时补充液氮。D>蛋自质污染：不要吸入中间层及有机相， 加入氯仿后首先混匀， 并且离心分层的离心力和时间要足够。>>D>减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法：重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相， 加入氯仿后首先混匀， 并且离心分层的离心力和时间要足够。>解决办法：重新抽提一次，再沉淀，溶解。D>>D>抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮 RNA,75%乙醇。并且彻底去掉解决办法：再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定0D260及0D280数值时， 要使0D2600. 10-0. 50读数在之间。此范围线 性最好。D>用水稀释样品：测 OD 时，对照及样品稀释液请使用水作为稀释液将导致比值