核酸扩增检测实验室设计及工作流程

1、核酸扩增检测设计及工作流程临床检验中心Tel.: 2014.9.11-14 长沙问题？l 核酸检测到底要分多少个区？l 缓冲间有何作用？l 使用什么样的生物安全柜？l “无l 核酸检测是什么？”或“无核酸”概念？最有效的“防污染措施”血液标本的接收l 通常的工作流程：标本血清分离编号保存或检测四个测定区域之外的地方或区域内接收l 接收的标本应收集在原始容器中ll 在核酸提取时带入至标本区标本的接收区的仪器设备要求l 如果在标本接收区分离血清（浆）标本，有1台分离血清（浆）用离心机、1台生物安全柜、1台冰箱、加样器及相应经高压处理的消耗品如带滤芯吸头、标本接收编号及记号笔等即可。本以l 如果不在

2、标本接收区分离血清（浆）标本，只是简单的接收，则就不需要分离血清（浆）用离心机、生物安全柜、加样器及其消耗品。设计A理想的核酸扩增产物分析区空气流向 扩增区空气流向标本区空气流向试剂准备区空气流向缓冲间缓冲间缓冲间走廊工作流向设计B理想的核酸扩增产物分析区空气流向 扩增区空气流向标本区空气流向试剂准备区空气流向缓冲间缓冲间缓冲间走廊工作流向核酸扩增检测设计的一般原则(1)在物理空间上，必须是完全相互的，各l 各区区域无论是在空间还是在使用中，应始终处于完全的分隔状态; (2)不能有空气的直接相通。l 注意风向由清洁区域向污染区域l 因地制宜“十六字口诀”l 方便工作A门外走廊门B门门外走廊扩增

3、及产物 分析区标本区试剂准备区门门标本区扩增区门门产物分析区门试剂准备区门标本区空气流向门扩 增 及 产物分析区空气流向空气流向试剂准备区门门扩增和产物分析区空气流向其他试剂准备区空气流向其他其他走廊走廊其他空气流向标本区其他其他其他标本区空气流向+门扩增及产物分析区空气流向空气流向+试剂准备区门门门扩增和产物分析区空气流向+其他试 剂 准 备区空气流向其他其他空气流向走廊走廊其他空气流向+标 本区其他其他其他产物分析区扩增区标本区试剂准备区传递窗传递窗传递窗空气流向空气流向空气流向 空气流向缓冲间缓冲间缓冲间走廊工作流向核酸检测设计“各区注意风向因地制宜方便工作”应根据空间大小。所采用的检测

4、技术平台和工作量来决定分区的多少及各区域的缓冲间的功能是“空气的流向”。生物安全柜可考虑“A2”。产物分析区空气流向扩增区空气流向标本区空气流向试剂准备区空气流向缓冲间缓冲间缓冲间走廊工作流向关于“区域”合并l 如使用扩增和产物分析同时完成的实时荧光PCR仪进行核酸扩增检测，扩增区和产物分析以合并。l 如使用核酸提取、扩增及产物分析等均在一台仪器上完成的全自动核酸检测分析仪，标本区、扩增区和产物分析合并。“无”或“无核酸”概念的重要性！尊敬的您好！来信请教一个问题，具体情况是这样的：我这儿使用的PCR仪是ABI 7300，用的是达安公司的HBV- DNA试剂，去年12月中旬的一次试：刘大夫：P

5、CR一旦出现严重污染，消除将会比较，通常可采用下述方法：（1）开窗;（2）采用次氯酸钠溶液擦地面及实验台验中发生了爆管，发生后， 处理，;（3）增长紫外面，甚至已经按照SOP规程进行了照射时间；（4）用75%乙醇空中喷雾，然后用于次氯酸钠溶液擦地面及实验台面。上述措施每天都要进行，直至污染消除。不知你是否按上述方法进行？如没有，你可以这样试，并请将效果告诉我。到现在已经有半年了，可还是不能消除污染。PCR在三楼，现在即使加样操作放在同一幢楼房的一，其余如混匀、离心等还放在原来的，扩增也对照孔所加在原来的对照，标本一样处理（因此暴露在空气中的时间很短），阴性对照有扩增，大约在21个循此外，在出现

6、严重污对照显示的Ct环的时候开始，染后，如还要进行工作，则可临时更换一个厂家试剂， 应就可以。约为26左右。请问这是什么，怎么处理才能消除污染。盼指点！刘X2013050820130508尊敬的：您好！我是上次您好！您所说的措施我向您请教PCR污染都实行过，只不过除外，如何清除的小刘，我们按照您的指点进行处理，现其余措施仅实施过很少几次，我将按您所说措施处理一段时间再看看。另外，再请教两个问题：（1）上述措施在污染已经完全清除，非常感谢！以后我们会更加注意操作的规范及相关知识的学习！要在三个进行吗？（2）楼房第三层污染，在第一层操作怎么也会受到影响？您拨冗指教！刘X2013.7.1820130

7、508原来是在作怪2011年五大科学The Scientist符合基本要求的核酸扩增检测的条件（1）试剂准备区、标本区和扩增及产物分析区等三l个或四个区域在物理空间上，必须是完全相互的，各区域无论是在空间还是在使用中，应始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。（2）各区的可移动的仪器设备及各种物品包括实验l本、记号笔、试管架及清洁用具等必须。（3）标本区、扩增及产物分析区等相对有可能l出现“污染物”的区域安装排风扇或其它排风和有效的装置，以使空气按试剂准备区®标本区®扩增（及产物分析）区方向。核酸扩增的工作流程试剂准备区标本区扩增区及扩增产物分析区试剂贮存准备区l 核

8、酸扩增中最为“洁净”的区域，不应有任何核酸的存在，包括试剂中所带的标准品和阳性对照。l 所有实验用洁净物品如离心管、吸头等的存放和准备处。l 商品试剂盒： 75%乙醇、焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水、等可能需要自配试剂：一次较大量配制，然后分装成小瓶保存，每次检测时，取出一小瓶使用，未用完的即弃掉，不再使用。ll 仪器设备主样器、天平、离心机和冰箱等，最好配备超净工作台。标本区仪器设备主要有设备、核酸提取仪、生物安l全柜、加样器、高速台式（冷冻）离心机、加热模块或水浴箱、冰箱等。生物安全柜不应放在实验室门口等易受对分体式空调。走动影响的地方，也不应直主要是用于血液样本的加样器吸头必须带滤芯。、核酸样本的提取。ll使用加热模块时，如在模块砂，然后将标本管置于细砂中填入二氧化硅细，可得到较为l一致的温度。扩增及产物分析区l 扩增反应体系的配制和提取核酸的加入，可在标本区也可在本区内进行，关键是要防止产物的污染。如果空间区域内进行。的话，也可在一个的l 加样时，先加提取的核酸模板样本，每加完一个即标本盖子，然后加阳性质控核酸模板，再就是质控和仅含按样本一样稀释的主反应混合液的扩增质控，这样做的目的是，最大可能地测出以前扩增产物的交叉污染。扩增及产物分析区l 热循环仪的电源应