电镜酶细胞化学技术-七年制

1、 Electron microscopic cytochemistry technique生物电镜技术生物电镜技术 电镜放射自显影法电镜放射自显影法 电镜免疫组织和细胞化学电镜免疫组织和细胞化学 电镜电镜X X线微区分析线微区分析 糖类、脂类和糖类、脂类和酶类电镜细胞化学酶类电镜细胞化学 电镜酶细胞化学电镜酶细胞化学 ( electron microscopic enzyme cytochemistry ) 在电镜下通过酶的特异细胞化在电镜下通过酶的特异细胞化学反应，显示酶在细胞内定位的方学反应，显示酶在细胞内定位的方法。法。 * *一、电镜酶细胞化学的基本步骤一、电镜酶细胞化学的基本步骤1.

2、 1.取材和固定：取材和固定：n取材取材: :以以1mm1mm1mm1mm2mm2mm大小为宜。取材要大小为宜。取材要快。最好采用全身灌流或单一器官灌流的方快。最好采用全身灌流或单一器官灌流的方法，能较好地保存酶的活性及定位准确。法，能较好地保存酶的活性及定位准确。n固定固定: :固定剂要做到既保持酶活性，又保持细固定剂要做到既保持酶活性，又保持细胞的超微结构。胞的超微结构。 4%4%多聚甲醛多聚甲醛0.5%0.5%戊二醛混合液戊二醛混合液 ( (用二甲砷酸钠缓冲液配制）用二甲砷酸钠缓冲液配制） 根据酶反应的特性来选择固定液。根据酶反应的特性来选择固定液。 固定时间因酶的种类而异，几固定时间因

3、酶的种类而异，几minmin至几十至几十h h。2.2.固定后漂洗：固定后漂洗：目的是去除醛类固定液。目的是去除醛类固定液。0.1mmol/L0.1mmol/L二甲砷酸钠缓冲液二甲砷酸钠缓冲液(pH7.4)(pH7.4)， ，2h2h或过夜。或过夜。3.3.预切片预切片：采用恒冷箱切片或采用恒冷箱切片或振荡切片振荡切片，厚度，厚度为为404070m70m。4.4.预孵育预孵育: :目的是置换缓冲液。目的是置换缓冲液。将预切片置于无底物的孵育液内，将预切片置于无底物的孵育液内，2020,30min;,30min;用配制孵育液的缓冲液冲洗，用配制孵育液的缓冲液冲洗，44，次，次， 5 510min

4、/10min/次。次。5.5.孵育：孵育： 原理：原理： 酶分解酶分解 捕捉剂捕捉剂 底物底物初级产物初级产物 不溶性终产物不溶性终产物 在在振荡式恒温（振荡式恒温（3737）水浴箱）水浴箱中进行。中进行。 孵育时间长短因不同实验而定孵育时间长短因不同实验而定( (应边孵育边应边孵育边在光镜下检查在光镜下检查) ) 。6.6.孵育后漂洗：孵育后漂洗：目的是去除残留物，尤其是铅离子。目的是去除残留物，尤其是铅离子。 * *先用配孵育液的缓冲液漂洗，先用配孵育液的缓冲液漂洗， 44，次，次，min/min/次；次； * *再用再用0.1mmol/L0.1mmol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗，二甲砷酸钠

5、缓冲液漂洗，44，次，次; ; min/min/次。次。7.7.后固定：后固定：1%1%锇酸，锇酸，44，h h。8.8.脱水及包埋脱水及包埋：乙醇、丙酮系列脱水；环氧乙醇、丙酮系列脱水；环氧树脂包埋。树脂包埋。9.9.超薄切片：超薄切片：取厚切片表面酶反应充分的部取厚切片表面酶反应充分的部分，切片厚度为分，切片厚度为707090nm90nm，用，用镍网或金网镍网或金网捞片。捞片。10.10.电子染色：电子染色：注意注意要排除染色对细胞化学反要排除染色对细胞化学反应产物的干扰后，再进行染色应产物的干扰后，再进行染色( (可单染或不可单染或不染色染色) ) 。 二、常见的酶及其在细胞中的定位二、

6、常见的酶及其在细胞中的定位 酸性磷酸酸性磷酸酶酶溶酶体溶酶体 碱性磷酸酶碱性磷酸酶细胞膜细胞膜 ATPATP酶酶细胞膜细胞膜 葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸酶磷酸酶内质网内质网 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶线粒体内膜、嵴线粒体内膜、嵴 单胺氧化酶单胺氧化酶线粒体外膜、嵴线粒体外膜、嵴 细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶线粒体线粒体 过氧化氢酶过氧化氢酶微体微体 焦磷酸硫胺素酶焦磷酸硫胺素酶高尔基体高尔基体 髓过氧化物酶髓过氧化物酶粒细胞及单核细胞内质网、粒细胞及单核细胞内质网、 核膜、高尔基体核膜、高尔基体 乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶内质网、核膜、突触间隙内质网、核膜、突触间隙 5-5-核苷酸酶核苷酸酶质膜质

7、膜三、电镜酶细胞化学的注意事项三、电镜酶细胞化学的注意事项n固定液的纯度：戊二醛需用活性碳处固定液的纯度：戊二醛需用活性碳处理纯化理纯化2 23 3次，次，44保存。保存。 n孵育液：孵育液的成份比例要严格。孵育液：孵育液的成份比例要严格。配制的试剂要用化学纯配制的试剂要用化学纯(GR)(GR)或分析纯或分析纯(AR)(AR)。最好是进口试剂最好是进口试剂。要现用现配，。要现用现配，按配方顺序加入各试剂，并随时搅拌；按配方顺序加入各试剂，并随时搅拌；用新鲜双蒸水配制；使用前经双层滤用新鲜双蒸水配制；使用前经双层滤纸过滤纸过滤, , 配好后调整配好后调整pHpH值。值。n孵育对照孵育对照：1.

8、1. 孵育液中去除底物孵育液中去除底物。 2. 2. 孵育液中加入底物抑制剂。孵育液中加入底物抑制剂。 3. 3. 使酶失活或加入酶活性抑制剂。使酶失活或加入酶活性抑制剂。 4. 4. 用酶活性激动剂。用酶活性激动剂。n孵育后标本处理：孵育后标本处理： 后固定时间要小于后固定时间要小于1h1h，以免组织变，以免组织变脆；脱水时间要缩短；电子染色前脆；脱水时间要缩短；电子染色前要先观察未染色的切片，确定有无要先观察未染色的切片，确定有无干扰。干扰。n 所用器皿要清洁干净，避免和金所用器皿要清洁干净，避免和金属接触。属接触。电镜线显微分析技术电镜线显微分析技术 electron microscop

9、ic X-ray microanalysis 利用电镜中具有一定能量的细聚焦电利用电镜中具有一定能量的细聚焦电子束轰击生物样品的某一微小区域，使其子束轰击生物样品的某一微小区域，使其内部各元素分别激发出不同波长或不同能内部各元素分别激发出不同波长或不同能量的特征量的特征X X线。线。 通过检测特殊通过检测特殊X X线的能量和波长来确线的能量和波长来确定微区中元素的性质，进行定性分析；通定微区中元素的性质，进行定性分析；通过检测特征过检测特征X X线的强度来确定微区中各元线的强度来确定微区中各元素的含量，进行定量分析的技术素的含量，进行定量分析的技术。一、基本原理一、基本原理 ( (一一)X)X

10、线的产生：线的产生： X X线是线是18951895年伦琴发现的波长范围年伦琴发现的波长范围0.10.1100100 的的电磁辐射，分为特征电磁辐射，分为特征X X线和连续线和连续X X线。线。1. 1.特征特征X X线线 入射电子轰击样品，使其原子内壳层发生电离入射电子轰击样品，使其原子内壳层发生电离产生空位，由外壳层电子填补空位时，以辐射产生空位，由外壳层电子填补空位时，以辐射的形式释放出来的能量称为特征的形式释放出来的能量称为特征X X线。线。 原子由原子核原子由原子核(质子、中子质子、中子)和核外电子组成。和核外电子组成。 * * 核外电子位于壳层上（核外电子位于壳层上（K K、L L

11、、MM、NN等壳层）；等壳层）； * * 每个壳层还可分为若干亚壳层；每个壳层还可分为若干亚壳层； * * 靠近原子核的壳层能量最低。靠近原子核的壳层能量最低。特征特征X X线产生过程与条件线产生过程与条件n基态基态: :在正常情况下核外电子首先占据低能在正常情况下核外电子首先占据低能级的壳层，这时原子的能量最低，处于稳定级的壳层，这时原子的能量最低，处于稳定状态称为基态。状态称为基态。n电离电离: :当入射电子轰击样品时，原子内壳层当入射电子轰击样品时，原子内壳层失去电子出现电子空位，这个现象称为电离。失去电子出现电子空位，这个现象称为电离。n激发态激发态: :发生电离时，原子因吸收了外界的

12、发生电离时，原子因吸收了外界的能量而使总能量上升，处于不稳定状态，这能量而使总能量上升，处于不稳定状态，这时称为激发态。时称为激发态。n临界激发能临界激发能: :指将原子壳层电子轰出轨道的指将原子壳层电子轰出轨道的最低能量称为临界激发能。最低能量称为临界激发能。u原子内壳层失去电子，产生电子空位（电离）。原子内壳层失去电子，产生电子空位（电离）。u外壳层电子填补电子空位，释放特征外壳层电子填补电子空位，释放特征X X线。线。基态原子基态原子入射入射电子电子原子内壳原子内壳层电离层电离电子跃迁电子跃迁特征特征X线线激发态原子激发态原子填补电子空位填补电子空位n2.2.连续连续X X线线 指从某一

13、极短波长开始，包括连续不断的指从某一极短波长开始，包括连续不断的各种波长在内的各种波长在内的X X线。线。产生过程：连续产生过程：连续X X线是由入射电子与原子核相线是由入射电子与原子核相 互作用而产生的。互作用而产生的。特点及意义特点及意义v连续连续X X线有极短波长。线有极短波长。v连续连续X X线强度具有极大值。线强度具有极大值。v连续连续X X线是样品中全部元素的原子共同产生的。线是样品中全部元素的原子共同产生的。v连续连续X X线构成特征线构成特征X X线的背景。线的背景。v连续连续X X线决定峰背比线决定峰背比。( (二二)X)X线的检测线的检测1. 1.波长色散型波长色散型X X

14、线线显微分析法显微分析法 （wave length dispersive X-ray microanalysis,WDXwave length dispersive X-ray microanalysis,WDX） 原理：原理： 特征特征X X线经某种晶体衍射后进入检测器，根线经某种晶体衍射后进入检测器，根据出现据出现 波峰时衍射角的大小来确定波峰时衍射角的大小来确定X X线的波线的波长。从而确定样品所含元素的性质；波峰上长。从而确定样品所含元素的性质；波峰上的峰值反映特征的峰值反映特征X X线的强度，经标准品测定线的强度，经标准品测定或元素纯样品校正后，来确定元素的含量。或元素纯样品校正后，

15、来确定元素的含量。n优点优点 * *适用于适用于4Be92U4Be92U之间原子序数元素的检测。之间原子序数元素的检测。 * *能量分辨率达能量分辨率达510keV510keV。 * *分析区域分析区域1m31m3以上。以上。 * *检出敏感度达检出敏感度达1010-15-15g g 。n缺点缺点 * *需配置多种晶体。需配置多种晶体。 * *晶体转换费时，故分析速度慢（晶体转换费时，故分析速度慢（2030min2030min）。）。 * *不能同时进行全元素分析。不能同时进行全元素分析。2.2.能量分散型能量分散型X X线显微分析法线显微分析法（Energy dispersive X-ray

16、 microanalysis,EDXEnergy dispersive X-ray microanalysis,EDX） 原理：原理： 特征特征X X射线经铍窗进入锂漂移硅检测器，使其射线经铍窗进入锂漂移硅检测器，使其内硅原子发生电离，产生电荷（与内硅原子发生电离，产生电荷（与X X线能量成线能量成正比）形成电脉冲信号经过放大后转变为电压正比）形成电脉冲信号经过放大后转变为电压脉冲，再输送到多道分析仪上进行脉冲幅度分脉冲，再输送到多道分析仪上进行脉冲幅度分析，积分后显示在荧光屏或计算机记录仪上。析，积分后显示在荧光屏或计算机记录仪上。谱线的位置代表元素的性质；脉冲的高度代表谱线的位置代表元素的

17、性质；脉冲的高度代表元素的相对含量。元素的相对含量。n优点优点 * *各种元素的峰值同时出现各种元素的峰值同时出现(23min),(23min),故检测效故检测效率高。率高。 * *测量元素范围测量元素范围11Na92U11Na92U。 * *检出敏感度达检出敏感度达1010-18-18g g以下，分析区域以下，分析区域30nm30nm。n 缺点缺点 * *能量分辨率在能量分辨率在100150KeV100150KeV。 二二. .电镜电镜X X线显微分析生物样品制备线显微分析生物样品制备 原则原则 * * 很好地保存生物样品的超微结构。很好地保存生物样品的超微结构。 * * 维持样品化学组成的

18、原有状态，避免引起维持样品化学组成的原有状态，避免引起 元素分布的移位和不必要的外来元素的沉积。元素分布的移位和不必要的外来元素的沉积。 * * 制样所用的化学物质不能干扰被分析的元素。制样所用的化学物质不能干扰被分析的元素。 * * 要同时制备生物标准样品。要同时制备生物标准样品。（1 1）冰冻切片法：）冰冻切片法： 样品用样品用0.1-1%0.1-1%戊二醛与戊二醛与2 2 4%4%甲醛固定，入甲醛固定，入0.60.6 2.3mol/L2.3mol/L蔗糖液浸透后在液氮中冷冻。用蔗糖液浸透后在液氮中冷冻。用冷冻超薄切片机切片，温度为冷冻超薄切片机切片，温度为9090 110110，厚度厚度

19、200nm200nm 2m 2m。切片置于铜网上，冷冻干。切片置于铜网上，冷冻干燥后喷碳，再进行微区元素分析。燥后喷碳，再进行微区元素分析。（2 2）离子沉淀法：）离子沉淀法：( (焦锑酸钾沉淀钙离子的方法焦锑酸钾沉淀钙离子的方法) ) 前固定采用前固定采用2%2%焦锑酸钾焦锑酸钾3%3%多聚甲醛多聚甲醛1.25%1.25%戊二醛戊二醛. . 后固定采用后固定采用2%2%焦锑酸钾焦锑酸钾+1%+1%锇锇酸酸. .其余步骤同常规电镜样品制备方法。其余步骤同常规电镜样品制备方法。注意事项注意事项 * * 固定液内要避免含有重金属元素；用固定液内要避免含有重金属元素；用 0.010.01 0.02N

20、0.02N冰醋酸配制；冰醋酸配制； * * 戊二醛与多聚钾醛混合后，倒入焦锑酸钾戊二醛与多聚钾醛混合后，倒入焦锑酸钾 中，以免发生沉淀；中，以免发生沉淀； * * 一般不用电子染色。一般不用电子染色。 电镜核酸原位杂交技术电镜核酸原位杂交技术Electron microscopic nucleic acid in situ hybridization technique 指在电镜下应用已知碱基序列并带有标记指在电镜下应用已知碱基序列并带有标记物的核苷酸探针与组织细胞中待测的核酸分子按物的核苷酸探针与组织细胞中待测的核酸分子按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体。碱基配对的原则进行特异性结合

21、，形成杂交体。然后应用与标记物相应的检测系统，通过免疫细然后应用与标记物相应的检测系统，通过免疫细胞化学或亲合细胞化学的方法在核酸原有位置上胞化学或亲合细胞化学的方法在核酸原有位置上进行细胞内定位的技术。进行细胞内定位的技术。n1971年年 出现放射性同位素出现放射性同位素(3H)标记探针。标记探针。n1986年年 应用生物素化核苷酸探针，并以免疫应用生物素化核苷酸探针，并以免疫细胞化学或亲合细胞化学法作为显色系统。细胞化学或亲合细胞化学法作为显色系统。n1993年年 出现了地高辛标记的核苷酸探针。出现了地高辛标记的核苷酸探针。*一. .探针的标记物探针的标记物 ( (一一) )放射性同位素放

22、射性同位素 32P 35S 125I 3H优点：灵敏度高，可检测拷贝数少的基因组。优点：灵敏度高，可检测拷贝数少的基因组。 特异性高。特异性高。缺点：对人体有辐射危害。缺点：对人体有辐射危害。 半衰期较长半衰期较长 （ 32P 14.3天天, 35S87.1天天,125I60天天, 3H12.3年年）。）。 费用高。费用高。 操作复杂。操作复杂。(二二)非同位素非同位素 金属金属(Hg) 荧光素荧光素(FITC) 半抗原（地高辛）生物素半抗原（地高辛）生物素 酶酶(HRP、AKP)优点优点: 价格便宜、操作简单、无半衰期、价格便宜、操作简单、无半衰期、 短期出结果。短期出结果。缺点：灵敏度低。

23、缺点：灵敏度低。二二. .电镜原位核酸杂交的步骤电镜原位核酸杂交的步骤（电镜下多选用非放射性生物素化的核酸（电镜下多选用非放射性生物素化的核酸探针，常以探针，常以胶体金胶体金作为显示系统）作为显示系统）杂交原则杂交原则 * * 使靶核酸保持天然位置与生化活性。使靶核酸保持天然位置与生化活性。 * * 使细胞和组织的超微结构保存良好。使细胞和组织的超微结构保存良好。 * * 保证低本底及高杂交率。保证低本底及高杂交率。(一一)杂交前准备杂交前准备1.固定固定 要选择能保持细胞结构，并能最大限要选择能保持细胞结构，并能最大限度地保持细胞内度地保持细胞内DNA或或RNA水平，使探针水平，使探针易于进

24、入细胞的固定液易于进入细胞的固定液。 常用固定液常用固定液: 4%多聚甲醛多聚甲醛 4%多聚甲醛多聚甲醛+0.13%戊二醛戊二醛 固定时间固定时间: 15min至至18h、42.杂交用器皿及组织样品的处理杂交用器皿及组织样品的处理(1)杂交用器皿及试剂的处理杂交用器皿及试剂的处理 注意要抑制注意要抑制RNA酶活性酶活性玻璃器皿：玻璃器皿： 过酸过酸0.04%二乙基焦磷酸盐二乙基焦磷酸盐(DEPC)冲洗冲洗用前应高压消毒过酸用前应高压消毒过酸清洗烘干清洗烘干95%AIC浸泡浸泡24hrddH2O清洗清洗高温高温150烘干过夜。烘干过夜。金属器械：冲洗、高温烘烤金属器械：冲洗、高温烘烤试剂：加入试

25、剂：加入0.04%DEPC载网载网: 镍网，上面覆有喷碳的镍网，上面覆有喷碳的formvar膜膜操作操作: 戴乳胶手套和口罩戴乳胶手套和口罩(2)组织样品的处理组织样品的处理 目的是增强组织的通透性和核酸探针的穿透性目的是增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 0.03%TritonX-100/PBS 210min 蛋白酶蛋白酶K/PBS 37 10min 检测检测DNA用用0.33mg蛋白酶蛋白酶K/PBS 37 10min 检测检测RNA用用210g蛋白酶蛋白酶K/PBS 37 10min (蛋白酶蛋白酶K可消化蛋白质，使核酸序列从结合的蛋可消化蛋白质，使核酸序列从结合的蛋白中释放出来；还可以

26、使细胞易被探针与金粒子穿透，白中释放出来；还可以使细胞易被探针与金粒子穿透，提高杂交信号。提高杂交信号。) 用用0.1mol/L甘氨酸甘氨酸/PBS清洗可中止反应。清洗可中止反应。(二二)杂交杂交1.包埋前杂交包埋前杂交 标本固定后先进行核酸杂交及杂交显示标本固定后先进行核酸杂交及杂交显示, 然后再进行常规电镜样品的制备过程。然后再进行常规电镜样品的制备过程。优点优点: : 可避免包埋过程中造成的可避免包埋过程中造成的RNA丢失。丢失。 避免包埋剂对探针的屏障作用。避免包埋剂对探针的屏障作用。 多用于培养细胞或悬浮细胞。多用于培养细胞或悬浮细胞。缺点缺点: : 对细胞进行增强穿透性与蛋白酶消化处理，对细胞进行增强穿透性与蛋白酶消化处理，使某些细胞成分被提取，造成人为损伤。使某些细胞成分被提取，造成人为损伤。