眼基础课件分子克隆技术（15-4-16）

1、分子克隆技术 Molecular Cloning主讲人：叶菊秀 副研究员温州医学院附属眼视光学院（医院）E-mail : Tel:159577295462015-04-16 遗传学发展史重组DNA技术的发展史19世纪中叶，达尔文创立了以自然选择为核心的进化论： 他认为，生物之间存在着生存争斗，适应者生他认为，生物之间存在着生存争斗，适应者生存下来，不适者则被淘汰，这就是自然的选择。生存下来，不适者则被淘汰，这就是自然的选择。生物正是通过遗传、变异和自然选择，从低级到高级，物正是通过遗传、变异和自然选择，从低级到高级，从简单到复杂，种类由少到多地进化着、发展着。从简单到复杂，种类由少到多地进化着

2、、发展着。 以上三点，就是我们常听到的以上三点，就是我们常听到的“物竞天择，适者物竞天择，适者生存生存”，现在基因学诞生之际，为此提供了重要的，现在基因学诞生之际，为此提供了重要的证据，事实上，物竞天择，竞的是证据，事实上，物竞天择，竞的是“基因基因”。遗传学的奠基人 -现代遗传学之父孟德尔现代遗传学之父孟德尔1865年，发现遗传定律。年，发现遗传定律。1866年，年，植物杂交试验植物杂交试验正式发表。正式发表。1881年，该论文列进了德国学者编了一本植物学杂交论文的目录。年，该论文列进了德国学者编了一本植物学杂交论文的目录。1900年，被年，被3个国家个国家3位学者同时发现。位学者同时发现。

3、从此，应验了孟德尔去世之前曾经之说从此，应验了孟德尔去世之前曾经之说-“我的时代来临我的时代来临”荷兰的德荷兰的德.弗里斯弗里斯 澳大利亚的契马克澳大利亚的契马克 德国的柯伦斯德国的柯伦斯1822-1884 遗传信息的传递规律和物质基础遗传信息的传递规律和物质基础 孟德尔的功绩：孟德尔的功绩： 采用32个品种 观察了7对性状 经8年研究，发现了2个定律: 独立分配和自由组合定律， 创立了“ 遗传学 ” 。 孟德尔定律（孟德尔定律（MendelMendels lawss laws）对一对性状的观察得出的对一对性状的观察得出的三条规律：三条规律：1）F1代的性状一致，通常和一个亲 本相同。得以表现

4、的性状为显性， 未能表现的性状称隐性。2）在杂种F2代中，初始亲代的二种 性状（显性和隐性）都能得到表达；3）这两性状的比例总为 3：1。 1906年，英国遗传学家贝特森贝特森创立的Genetics，这个词的整个含意就是研究“出生与祖先关系的科学” 。 贝特森把决定相对性状的孟德尔式的遗传因子简化成现在通用的“等位基因 (allele)”，创造了“纯合子(homozygote)”、“杂合子(heterozygote)”以及“上位基因(epistatic gene)”等遗传学术语。The term genetics is used for the first time“遗传学遗传学”名称的由来名

5、称的由来 1909年，年，丹麦生物学家丹麦生物学家约翰逊根据希腊文根据希腊文“给予生命给予生命”之义，创造了基因（之义，创造了基因（gene）一词，提出了基因型（一词，提出了基因型（genotype）和表现和表现型型 （phenotype）的概念。的概念。 1910年 摩尔根（摩尔根（Morgan ）及其）及其3个学生个学生 斯特蒂文特（斯特蒂文特（Sturtevant）、布里）、布里吉斯（吉斯（Bridges）、）、 缪勒（缪勒（Muller） 创立了创立了连锁定律（遗传学第三大定律）遗传学第三大定律）1915年 共同出版的遗传学经典名著共同出版的遗传学经典名著孟德尔遗传学原理孟德尔遗传学原

6、理，确定了，确定了基因基因是染色体是染色体上的分散单位。上的分散单位。 1933年年 摩尔根被授予诺贝尔奖摩尔根被授予诺贝尔奖 ，1934年领奖，奖金分给了自己、斯特蒂文特年领奖，奖金分给了自己、斯特蒂文特和布里吉斯三家的孩子和布里吉斯三家的孩子摩尔根与其果蝇实验室摩尔根与其果蝇实验室 缪勒（Muller） 1927年证明X光可以诱导基因突变，其作用与X射线的剂量相关。 1946年获得了诺贝尔奖。基因基因是一个抽象的遗传因子，既是功能单位，又是重组单位和突变单位。是一个抽象的遗传因子，既是功能单位，又是重组单位和突变单位。Avery艾佛瑞McLeod麦克赖欧德McCarty麦克卡提1944年，

7、Avery等提出DNA是最基本的遗传物质1952年，Herskey用T2噬菌体证明了噬 菌体的遗传物质是DNA， 1969 赫尔希由此获得诺贝尔奖。伴随着遗传学的发展，分子生物学孕育而生（1900-1952，孕育阶段）Hershey赫尔希 1953年，年， Watson和和 Crick建立建立DNA双螺旋模型，双螺旋模型， 1962年年，获得了诺贝尔奖。，获得了诺贝尔奖。开启了分子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次，开启了分子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次，“生命之谜生命之谜”被打开，人们被打开，人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径。清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径。Wat

8、sonCrick生命的奥秘蕴藏于生命的奥秘蕴藏于 “四字天书四字天书”之之中中Secrets in the Secrets in the “4 Letter Book4 Letter Book” of Life of LifeGCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCA TCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCT CCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTC GCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCTLife is sequen

9、ce -coded! 1958年，Crick中心法则分子生物学时代DNARNAProteinTranscriptionTranslationReverse TranscriptionReplicationFigure 4-6 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)1958年，Meselson 和Stahl DNA半保留复制。1961年，Jacob 和Monod操纵子学说1961年，Nirenberg破译第一个遗传密码1962年1968 Arber， 1978年 Smith 发现限制性酶1966年遗传密码破译：61种编码用于决定

10、20种氨基酸，另外3种则用来作为蛋白质合成的终止信号。 1972年， Berg建立重组技术（1980获得诺奖）1975年，Temin发现反转录酶分子生物学时代Paul Berg 1977年，Sanger & Gilbert 建立测序方法 1977年，Sharp 和 Roberts 发现内含子 1981年，Cech和Altman 发现核酶 1985年，Mullis建立了PCRPCR体外扩增技术体外扩增技术此期基因的概念是：此期基因的概念是： 一段可以转录为功能性RNA的DNA，它可以重迭、断裂的形式存在，并可转座。 分子生物学时代 PCR技术的不段发展 显微注射术开始转基因动物的研究 转

11、基因植物的诞生 基因治疗技术 人类基因组计划 克隆羊的诞生 胚胎干细胞的分离培养 基因敲除或敲入小鼠的建立 、分子生物学的发展ingDolly分子克隆 分子克隆技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一，即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。分子克隆（molecular cloning）又称为基因克隆、基因工程、DNA克隆、重组DNA技术克隆（Clone）： 指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。克隆化（cloning）： 获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。分子克隆（DNA克隆）细胞克隆个体克隆（动物或植物）分子克隆（重组DNA技术） 指按照人的意愿，在体外

12、将某种生物的DNA片断插入到载体（质粒、病毒等）中，形成遗传物质的新组合-重组DNA分子（重组子），然后将重组子转移到宿主细胞中进行复制或表达，即对DNA分子进行克隆，以获得该DNA分子的大量拷贝。可跨越物种屏障、把来自不同生物的基因进行新的组合，使得神话梦想成真！分子克隆（重组DNA技术）DNARNAProteinThe Central Dogma of Molecular BiologyReplicationTranscriptionTranslationDNAReverseTranscriptionSouthern BlotNorthern BlotWestern BlotRT-PCR分

13、获取目的基因和载体切切目的基因与载体的酶切目的基因与载体的酶切筛筛重组重组DNADNA的筛选与鉴定的筛选与鉴定转转重组重组DNADNA导入宿主细胞导入宿主细胞接接目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接DNADNA克隆的基本过程克隆的基本过程分：分： 基因载体基因载体 目的基因目的基因 质粒质粒 噬菌体噬菌体 病毒病毒 直接分离直接分离 cDNA 人工合成人工合成 基因文库基因文库切：切： 限制性内切酶限制性内切酶 有缺口的载体有缺口的载体 目的基因目的基因接：接： 连接酶连接酶 粘端连接粘端连接 平端连接平端连接 尾接法尾接法 重组体重组体转：转： 转化转化 转染转染 体外包装体外包装 带重

14、组体的宿主带重组体的宿主筛：筛： 表型筛选表型筛选 电泳法电泳法 核酸杂交核酸杂交载体载体DNADNA（vectorvector）目的目的DNADNA（target fragmenttarget fragment）重组重组DNADNA（recombinant DNA recombinant DNA ）宿主（宿主（hosthost）筛选、扩增筛选、扩增克隆（克隆（cloneclone）分子克隆的路线DNA DNA 重组重组转化转化载体的特性载体的特性1分子较小，可携带比较大的分子较小，可携带比较大的DNADNA片段片段载体的特性载体的特性能独立于染色体而进行自主能独立于染色体而进行自主复制并且是

15、高效的复制复制并且是高效的复制2有时还要求载体要能启动外源有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达可能是高效的表达43要有尽可能多种限制酶的切要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点要最少的切割位点5从安全角度考虑，要求载体不从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制验室内特殊菌种内才可复制 有适合的标记，易于选择有适合的标记，易于选择61 12 23 34 4质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体酵母菌质粒载体酵母菌质粒载体动植物病毒

16、载体动植物病毒载体克隆载体克隆载体质粒载体质粒载体 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约为数千碱基对，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做 为选择性标记的抗 药性基因，所以质 粒经过适当改选后 便可成为良好的载 体载体特征：载体特征：1.能自主复制的复制子2.可供筛选的遗传标记3.适当大小的分子量4.合适的限制性内切酶位点，方便外源基因的插入5.在受体细胞中高效复制Different plasmids compete each other for growing利用同一复制系统的两个质粒会在复制和复制后向子细胞分配利用同一复制系统的两个质粒会在复制和复制后向子细胞分配过程中彼

17、此竞争。这样的质粒在过程中彼此竞争。这样的质粒在细菌培养物细菌培养物中不能和平相处。中不能和平相处。不能确保两个不同质粒在同一个菌落中的拷贝数一致不能确保两个不同质粒在同一个菌落中的拷贝数一致1.较大的质粒需要更多的复制时间，所以拷贝数就会与小的质粒较大的质粒需要更多的复制时间，所以拷贝数就会与小的质粒 比较起来处于弱势。比较起来处于弱势。2.即使大小一样，但效力不一样即使大小一样，但效力不一样。随着时间的延长，弱势质粒就会消失，很少有两种质粒共存随着时间的延长，弱势质粒就会消失，很少有两种质粒共存与同一细胞中与同一细胞中所以要比较不同质粒是否属于不同复制子，如相同则不能所以要比较不同质粒是否

18、属于不同复制子，如相同则不能共生在同一细胞中。共生在同一细胞中。质粒的不相容性质粒发展概况质粒发展概况 1. 第一阶段（第一阶段（1977年前）：年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322 2. 第二阶段：第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因，如区和新的遗传标记基因，如pUC系列载体。系列载体。 3.3.第三阶段：第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如要求，

19、如M13mp系列载体，含系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。达型载体及各种探针型载体。 如如pSC101质粒载体质粒载体 长长9.09kb，带有四环素抗性基因，带有四环素抗性基因（tetr）及）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及以及SmaI等等7种限制性核酸内切酶的单种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在酶切位点，在HindIII、BamHI和和SalI等等3个位点插入外源基因，会导个位点插入外源基因，会导致致tetr失活。失活。1、克隆载体2、表达载体TYPES OF VECTORS TA克隆的idea最初

20、来自1994年。几位学者发现TaqDNA聚合酶在PCR产物的3末端加上一个脱氧腺苷（A），而且这种特性与模板无关。之后，invitrogen公司发明了TA克隆技术，并拥有全球TA cloning商标的专利权。线性化的T载体在3末端拥有一个脱氧胸苷（T），与PCR产物的A尾巴互补。 Why Plasmids are Good Vectors small size (easy to manipulate and isolate) circular (more stable) replication independent of host cell several copies may be pre

21、sent (facilitates replication) frequently have antibody resistance (detection easy)Disadvantages using plasmids Cannot accept large fragments Sizes range from 0- 10 kb Standard methods of transformation are inefficient 噬菌体载体噬菌体载体一种典型的头一种典型的头- -尾结构，双链线状尾结构，双链线状DNADNA分子，全长分子，全长50kb50kb，含，含6666个基个基因，在其

22、分子两端各含有因，在其分子两端各含有1212个碱基的互补单链，是天然的粘性末个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为端，被称为COSCOS位点位点噬菌体噬菌体一种典型的纤维状结构，其一种典型的纤维状结构，其DNADNA分子相比分子相比噬菌体要小的多，长度噬菌体要小的多，长度仅仅64076407个核苷酸，通常为环状双链个核苷酸，通常为环状双链DNADNAM13噬菌体噬菌体噬菌体结构 它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内M13噬菌体的侵染过程噬菌体的侵染过程 M13以纤毛吸附大肠杆菌，并向其注入自身DNA 单链DNA注入宿

23、主细胞后，合成第二条链(双链复制模式 RF) RF DNA拷贝数达到100200个后 ,通过滚环复制机制产生线状单链DNA 包装成为成熟的噬菌体颗粒并从细菌体内溢出。 目的基因的获取目的基因的获取聚合酶链反应制备基因组DNA制备cDNA人工合成基因. .目的基因目的基因来源来源Specific DNA sequence can be amplifiedby PCR (polymerase chain reaction)Kary MullisKary B. Mullis (1944 -)，在在Cetus公司工作期间，公司工作期间，发明了发明了PCR。 他原本是要他原本是要合成合成DNA引物来进行

24、测序引物来进行测序工作，工作， 却常为没有足够多却常为没有足够多的模板的模板DNA而烦恼。而烦恼。1983年春夏之交的一个年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用的路上萌发了用两个两个引物引物（而不是一个引物）（而不是一个引物）去扩去扩增模板增模板DNA 的想法的想法.很少有在公司工作的科研人员得很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，诺贝尔奖， Mullis是其中之一是其中之一Mullis开车的时候开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开的两条链，自己的车和对面开来的车象是来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着聚合

25、酶，面对面地合成着DNA， Mullis的第一个的第一个PCR实验实验 1983年年9月中旬。月中旬。 Mullis在反应体系中加在反应体系中加 入入DNA聚合酶后在聚合酶后在37 一直保温。结果第二一直保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。聚合酶进行反应，依次循环。1983年年12月，他终于看到了被同位素标记月，他终于看到了被同位素标记的的PCR条带。条带。93年获得了诺贝尔奖年获得了诺贝尔奖PCRPCR( (聚合酶链

26、式反应聚合酶链式反应) )变性变性9595C C延伸延伸70-7570-75C C退火退火Tm-5Tm-5C C反应所需物质：DNA模板、引物、DNA聚合 酶、dNTP、缓冲液每个循环包括：变性、退火、延伸聚合酶链式反应（PCR）技术 核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。分子及蛋白质与核酸相互作

27、用的重要实验手段。 电泳的迁移率与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正电泳的迁移率与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。比，与片段大小成反比。琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA的大小范围（的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 501溴化乙锭染料的化学结构及溴化乙锭染料的化学

28、结构及其对其对DNADNA分子的插入作用。分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中胶电泳中DNADNA的条带便呈现的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。出橘黄色荧光，易于鉴定。PCR产物的凝胶电泳图PCR琼脂糖凝胶电泳最终产物紫外光观察3-4 小时从定性到定量的革命SYBR green法TaqMan体系logDNACycles不同样品有不同的生成曲线普通普通PCR和定量和定量PCR的区别的区别 适用定性分析，适用定性分析，不适合定量分析；不适合定量分析； PCR 产物的长产物的长度从度从100bp 数数kb 实时检测

29、实时检测:每个循环每个循环都产出荧光信号都产出荧光信号 绝对定量，灵敏度更绝对定量，灵敏度更高高 PCR产物的长度一般产物的长度一般在在 60-150 bps DNA工具酶工具酶A A 限制性内切酶限制性内切酶B B T4DNA连接酶连接酶C C TaqDNA聚合酶聚合酶D D 逆转录酶逆转录酶是一类由细菌产生的能专一识别和是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链切割双链DNADNA中的特定碱基序列的中的特定碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。根据限制酶作用特性，一般分为根据限制酶作用特性，一般分为、和和型，其中常用的是型，其中常用的是型限制型限制酶酶催化双

30、链催化双链DNADNA中一条链的中一条链的33OHOH与与另一条链的另一条链的55POPO3 3H H2 2形成磷酸二形成磷酸二酯键，从而构成完整的酯键，从而构成完整的DNADNA长链长链逆转录酶是一个多功能性酶，至少逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下具有以下3 3种酶活性：种酶活性： 以单链以单链RNARNA为模板，催化合成为模板，催化合成cDNAcDNA单链单链 具有具有RNaseHRNaseH活性，能水解活性，能水解RNA:DNARNA:DNA杂交链中的杂交链中的RNA RNA 以以DNADNA为模板，为模板，催化合成催化合成cDNAcDNA双链双链TaqDNATaqDNA聚合酶是一

31、种依赖聚合酶是一种依赖DNADNA的单的单亚基耐热亚基耐热DNADNA聚合酶，聚合酶， 主要用于聚主要用于聚合酶链式反应中，能以合酶链式反应中，能以DNADNA为模板，为模板，从结合在模板上的引物出发，以从结合在模板上的引物出发，以dNTPdNTP为原料，按碱基配对方式，从为原料，按碱基配对方式，从5-35-3方向合成新的方向合成新的DNADNA链。链。TaqDNATaqDNA聚合酶在聚合酶在70707575时具有最时具有最佳的生物活性佳的生物活性上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源自工具酶的发现。（一）限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个

32、核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。 几种主要DNA内切酶所识别的序列DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体 重组DNA导入宿主细胞转化：转化：以以质粒质粒作载体构建的重组体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程导入受体细胞的过程转染：转染：以以病毒病毒作载体构建的重组体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程导入受体细胞的过程转导：转导：以以噬菌体噬菌体作载体构建的重组作载体构建的重组体导入受体细胞的过程体导入受体细胞的过程类型 感受态细胞 受体细胞经过一些特殊方法（如CaCl2

33、、RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的细胞细菌转化及蓝白斑筛选 重组DNA的筛选与鉴定平板筛选（插入失活、蓝白筛选） 限制酶切图谱筛选PCR筛选重组体DNADNA测序技术测序技术4 41 12 23 3重组重组DNADNA的筛选与鉴定方法的筛选与鉴定方法 平板筛选 是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法。具有抗药性标记的载体转化宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转化的则不能生长 平板筛选的种类当外源当外源DNADNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上插入失活利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌蓝白筛选载体载体 宿主宿主编码编码-半乳半乳糖苷酶糖苷酶N N端序端序列列（IPTGIPTG存在）存在）编码编码-半乳半乳糖苷酶糖苷酶C C端序端序列列 - -互补互补细菌表达： -半乳糖苷酶活性5-溴-4-氯-3-吲哚（