第二章 DNA复制与损伤

1、3-1 DNA复制概貌3-2 DNA复制酶和相关蛋白3-3 DNA的复制过程第三章第三章 DNA的复制的复制3-4 DNA的修复3-5 DNA的突变DNA复制是一个由多种酶催化和有多种蛋白质参与的受到精密调控的过程； 3-1 DNA复制概貌DNA是细胞中唯一具修复系统的生物大分子。19581958年年MeselsonMeselson和和StahlStahl研究了经研究了经1515N N标记几代的大肠杆标记几代的大肠杆菌菌DNADNA，首次证明了，首次证明了DNADNA复制的半保留性。复制的半保留性。 一、一、DNADNA复制的半保留性复制的半保留性(Semiconservative repli

2、cation) 二、二、DNADNA的半不连续复制的半不连续复制DNA synthesis is semidiscontinuous（一）（一） 起点（原点起点（原点 origin）三、复制的起点、方向三、复制的起点、方向（即顺序性及复制单位） replication origin & direction许多实验证明，许多实验证明，DNA的复制是由固定的起始点的复制是由固定的起始点开始的。开始的。E.E.colicoli染色体复制原点染色体复制原点oriCoriC成串排列成串排列3 3个个13bp13bp重复序列重复序列(GATCTNTTNTTTT)(GATCTNTTNTTTT)反向重

3、复出现反向重复出现4 4个个9bp9bp序列序列(TTATCCACA)(TTATCCACA)复制子复制子（replicon）一般把生物体的独立复制单位称为复制子。一般把生物体的独立复制单位称为复制子。一个复制子只含有一个复制起点。即能启动即能启动DNADNA复制开始的基因组上的复制开始的基因组上的DNADNA顺序，包括复顺序，包括复制原点和引发复制的结构基因，以及在其控制下的制原点和引发复制的结构基因，以及在其控制下的DNADNA区段统称为复制子。区段统称为复制子。5 OHT C Appp OH CT C A C 5 OH 3+ ppi （二）子链（二）子链DNADNA延伸方向延伸方向 新链合

4、成只能从5 到 3 方向不同细胞的复制参数不同细胞的复制参数 原核生物原核生物（大肠杆菌）真核生物真核生物（人）细胞内复制子的细胞内复制子的数目（个）数目（个）1（1）多个（多个（103104）复制子平均长度复制子平均长度（kb）39106约约105106复制方向复制方向多为双向多为双向多为双向多为双向复制速度复制速度(bp/s/复制叉复制叉)等速（等速（850）等速（等速（6090）3-2 DNA复制酶和相关蛋白一、一、DNADNA聚合酶聚合酶DNA PolymeraseDNA Polymerase特点：特点：1.1.以以4 4种种dNTPdNTP为底物；为底物；2.2.反应需要接受模板反应

5、需要接受模板指导；指导；3.3.反应需要有反应需要有3-OH3-OH存在；存在；4.DNA4.DNA链的合成方向链的合成方向为为5 3 5 3 ；5.5.产物产物DNADNA的性质与的性质与模板相同。模板相同。( (一一)DNA)DNA聚合酶聚合酶I IDNADNA聚合酶聚合酶I I是一种多功能酶。包括：是一种多功能酶。包括：5 3 5 3 聚合酶活性聚合酶活性。3 5 3 5 核酸外切酶活核酸外切酶活性性。5 3 5 3 核酸外切酶活核酸外切酶活性性。从从33端将端将DNADNA链水解链水解， DNA的校对（的校对（proofreading）功能）功能。从从55端将端将DNADNA链水解链水

6、解，DNA的修复功能的修复功能。将将dNTPdNTP加到加到DNADNA链的链的3-OH3-OH上，上，DNA的聚合功能。的聚合功能。klenowklenow片断：片断：用枯草杆菌蛋白酶处理可以将用枯草杆菌蛋白酶处理可以将DNADNA聚合酶聚合酶I I水解为水解为一大一小两个片段。较大的一大一小两个片段。较大的C C末端片断分子量为末端片断分子量为68KD68KD，叫，叫klenowklenow片断，具有片断，具有5353的聚合酶活性和的聚合酶活性和3535的外切酶活性，的外切酶活性，常用做体外合成常用做体外合成DNADNA的工具酶。的工具酶。切口平移：切口平移：DNADNA聚合酶聚合酶I I

7、的的5353核酸外切酶活性从核酸外切酶活性从55端切端切除除DNADNA受损伤的部位，受损伤的部位，DNADNA聚合酶聚合酶I I的的5353聚合酶活性随即开聚合酶活性随即开始工作，使始工作，使DNADNA链向链向33端延伸，这称为切口平移（端延伸，这称为切口平移（nick nick translationtranslation）。）。 在在DNADNA复制中，复制中，RNARNA引物的切除；引物的切除；DNADNA的损伤修复；的损伤修复；在体外，制备高放射性活性的在体外，制备高放射性活性的DNADNA探针。探针。( (二二)DNA)DNA聚合酶聚合酶 多亚基不对称二聚体结构多亚基不对称二聚体

8、结构(10(10种亚基种亚基) ) 1.1.亚基、亚基、亚基和亚基和亚基相连组成核心酶亚基相连组成核心酶（core enzymecore enzyme） 亚基具有亚基具有5353的的聚合酶活性聚合酶活性. .亚基具有亚基具有3535的的外切酶活性外切酶活性. . 亚基可能起组建的亚基可能起组建的作用作用. .2.DNA2.DNA聚合酶聚合酶具有持续合成能力具有持续合成能力. .亚基亚基的功能犹如的功能犹如夹子夹子: :提高了酶的持续合成能力提高了酶的持续合成能力. . 夹子装置器（夹子装置器（clamp loaderclamp loader）: :两个两个亚基与另亚基与另4 4个个亚基（亚基（

9、亚基、亚基、亚基、亚基、亚基、亚基、亚基）构成亚基）构成复合物，其主要功能时帮助复合物，其主要功能时帮助亚基夹住亚基夹住DNADNA，故称，故称夹子装置器。夹子装置器。 亚基亚基是一种依赖于是一种依赖于DNADNA的的ATPATP酶酶 亚基亚基起促使核心酶二聚化的作用起促使核心酶二聚化的作用 二、二、DNADNA旋转酶旋转酶(DNA Gyrase)(DNA Gyrase)DNADNA旋转酶每作用一次产生两个负超螺旋旋转酶每作用一次产生两个负超螺旋, ,可去除解螺旋产生的可去除解螺旋产生的扭曲张力扭曲张力. .并依赖于并依赖于亚基催化亚基催化ATPATP水解水解, ,以使酶构象复原以使酶构象复原

10、. .DNADNA旋转酶的旋转酶的抑制剂抑制剂如香豆霉素、新生霉素、萘啶酮酸等均能如香豆霉素、新生霉素、萘啶酮酸等均能抑制细菌的合成抑制细菌的合成. .三、三、DNADNA解旋酶解旋酶( (DNA HelicaseDNA Helicase) )和单链结合蛋白和单链结合蛋白( (Single-strand DNA binding protein, Single-strand DNA binding protein, SSBSSB) )1.1.DNADNA解螺旋酶解螺旋酶是是利用利用ATPATP水解获得的能量水解获得的能量打断氢键打断氢键，解开双，解开双链链DNADNA并在并在DNADNA分子上分

11、子上沿一定方向沿一定方向移动的一类酶的总称。移动的一类酶的总称。 防止核酸水解酶的作用防止核酸水解酶的作用 避免解开的单链避免解开的单链DNADNA重新缔合形成双链重新缔合形成双链 对单链对单链DNADNA有很高的亲和性有很高的亲和性 它们与它们与DNADNA结合时有协同作用结合时有协同作用 2.2.单链结合蛋白（单链结合蛋白（ SSB SSB ）：）： RNA RNA 聚合酶聚合酶 Rif Rif S S 完成对先导链引物的合成完成对先导链引物的合成 实现实现DNADNA复制的转录激活起始复制的转录激活起始 引发酶引发酶 Rif Rif R R 完成对后随链引物的合成完成对后随链引物的合成

12、较先导链的启动落后一个较先导链的启动落后一个OkazakiOkazaki片断片断 完成完成10 10 NtRNANtRNA引物合成后引物合成后. DNApolII. DNApolII进行进行DNADNA链的延链的延伸伸 四、引发酶四、引发酶(Primerase)(Primerase)酶酶- AMP- AMP将腺苷酰基（将腺苷酰基（AMPAMP）转移给）转移给DNADNA切口处的切口处的55磷酰基团，磷酰基团，以焦磷酸的形式活化，形成以焦磷酸的形式活化，形成AMP-P-DNAAMP-P-DNA。 五、连接酶五、连接酶(Ligase)DNADNA连接酶催化双股链内相邻单链切口的连接酶催化双股链内相

13、邻单链切口的3-OH3-OH与与5- P5- P酰基形成磷酸酯键。酰基形成磷酸酯键。 酶的活化酶的活化通过相邻通过相邻DNADNA的的3-OH3-OH对活化的对活化的P P原子进行亲核攻击，生成原子进行亲核攻击，生成33，5-5-磷酸二酯键，同时释放出磷酸二酯键，同时释放出AMPAMP。 催化过程：催化过程： 腺苷酰化腺苷酰化DNADNA亲核攻击完成亲核攻击完成DNADNA连接连接需要需要NADNAD+ +或或ATPATP提供腺苷酰基（提供腺苷酰基（AMPAMP），与酶活性中心的赖氨酸残），与酶活性中心的赖氨酸残基的基的-NH-NH2 2以磷酰胺键结合，形成共价中间体酶以磷酰胺键结合，形成共价

14、中间体酶- AMP- AMP； 。 3-3 DNA的复制过程一、一、E.E.colicoli的的DNADNA复制复制（环型双股（环型双股DNADNA，双向，双向方式）方式）分为三个阶段：起始、延伸和终止分为三个阶段：起始、延伸和终止复制体（复制体（ReplisomeReplisome）：）：在在DNADNA合成的生长点，即复合成的生长点，即复制叉上，分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白质因子，制叉上，分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白质因子，它们构成复合物称为复制体。它们构成复合物称为复制体。DNADNA复制的阶段表现在于复制体结构的变化。复制的阶段表现在于复制体结构的变化。2.2.复制的终止复

15、制的终止1.1.环行环行E.E.colicoli染色体上的两个复制叉相遇在排列有许多重复拷染色体上的两个复制叉相遇在排列有许多重复拷贝贝TerTer序列（长约序列（长约22bp22bp）的一个终止区域（）的一个终止区域（terminusterminus），并停），并停止复制。止复制。 2.2.称为称为Tus (terminus utilizatlcon substanceTus (terminus utilizatlcon substance，终点利用物，终点利用物质）的蛋白质的结合于质）的蛋白质的结合于TerTer序列序列 ，Tus_TerTus_Ter复合物只能够阻止复合物只能够阻止一个方

16、向的复制叉。一个方向的复制叉。 3.E.3.E.colicoli分开连锁体需要拓扑异构酶分开连锁体需要拓扑异构酶（属于类型（属于类型topotopo酶）参与作用。分开两闭合环。酶）参与作用。分开两闭合环。 二、滚环复制（二、滚环复制（rolling rolling circle replicationcircle replication）X174X174的基因组的基因组DNADNA是单链环型是单链环型DNADNA，复制中首先合成其互补，复制中首先合成其互补链（而非其自身），形成复制型（链（而非其自身），形成复制型（replication form, RFreplication form, RF

17、），），然后进行滚环型（然后进行滚环型（roolling circleroolling circle）复制。）复制。滚环复制是在一条断裂的亲本链的滚环复制是在一条断裂的亲本链的3 3_OHOH上不断地发生上不断地发生DNADNA聚合物作用，因而也叫聚合物作用，因而也叫共价延伸（共价延伸（ covalence covalence elongationelongation ）。 三、三、D D环复制环复制（displacement replicationreplication）线粒体线粒体DNADNA的双股链分为轻链的双股链分为轻链和重链。它的复制是一种单和重链。它的复制是一种单向不对称的特殊复制

18、方式向不对称的特殊复制方式, ,称称为为环复制。环复制。复制从重链（链）的原点复制从重链（链）的原点开始，新合成的链置换原开始，新合成的链置换原来链，游离的单链称为取代来链，游离的单链称为取代链（链（displacementdisplacement）或环。）或环。 当链合成进行到约当链合成进行到约2/32/3时，时，轻链（链）的原点暴露出轻链（链）的原点暴露出来，并引发其合成，延伸方来，并引发其合成，延伸方向与链的相反。向与链的相反。 四、真核生物复制特点四、真核生物复制特点（一）真核生物（一）真核生物DNADNA复制与原核生物复制与原核生物DNADNA复制的复制的相同点。相同点。（二）真核生

19、物（二）真核生物DNADNA复制与原核生物复制与原核生物DNADNA复制的复制的不同点：不同点：真核真核DNADNA有多个复制原点；有多个复制原点；2 2真核生物染色体在全部复制完成之前不能再重新开始复制，真核生物染色体在全部复制完成之前不能再重新开始复制，而在快速生长的原核生物中起点可以连续发动复制。而在快速生长的原核生物中起点可以连续发动复制。 3 3真核生物复制的调控远比原核生物更为复杂。真核生物复制的调控远比原核生物更为复杂。 4 4真核生物有多种聚合酶。真核生物有多种聚合酶。 从哺乳动物中分出种从哺乳动物中分出种DNA polDNA pol酶。分别为酶。分别为polpol、。 Pol

20、Pol（4 4亚基）：有引物合成酶活性。具有合成亚基）：有引物合成酶活性。具有合成RNARNA后后45dNTP45dNTP的活性。无外切酶活性。持续性中等，约为的活性。无外切酶活性。持续性中等，约为100100核苷酸，完成滞核苷酸，完成滞后链后链DNADNA复制。复制。 PolPol（2 2亚基）：有持续合成亚基）：有持续合成DNADNA链的能力，有链的能力，有3 3 55 核酸外切核酸外切酶活性（具有校正功能），完成前导链酶活性（具有校正功能），完成前导链DNADNA复制。复制。 PolPol（11亚基）：相当于亚基）：相当于E.E.colicoli的的polpol，是一种修复酶，具，是一种

21、修复酶，具有有3 3 5 5 核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。 PolPol（1 1亚基）：与损伤修复有关。亚基）：与损伤修复有关。 PolPol（2 2亚基）：是线粒体亚基）：是线粒体DNADNA合成酶（合成酶（3 3 55 外切酶）外切酶） 五、真核生物端粒的复制五、真核生物端粒的复制 端粒端粒DNA (Telomer)(Telomer) TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端序列高度重复的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 (rich G chain) 3 AACCCC AACCCC AACCCC 5 (rich C chain) G链链 T2G4-TTG

22、GGGT TGGG C链链-A2C4- telomerase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 端粒酶端粒酶(tolomerase)(tolomerase)的催化过程的催化过程七、七、DNADNA复制的忠实性复制的忠实性1.DNA1.DNA复制是按碱基互补配对的原则进行的。复制是按碱基互补配对的原则进行的。 2.DNA2.DNA聚合酶本身具有校正功能。聚合酶本身具有校正功能。 5. DNADNA的错配校正和修复系统保证的错配校正和修复系统保证DNADNA复制的忠实性。复制的忠实性。3. RNA3. RNA引物的存在与清除有利于降低错配率。引物的存在与清除有利于降低错配率。 4. DN

23、A4. DNA聚合酶催化的反应机制，即聚合酶催化的反应机制，即DNADNA聚合酶仅催化聚合酶仅催化5 5 33 方向方向的反应。的反应。 3-4 DNA的损伤及修复一、一、DNADNA的损伤的损伤DNADNA的损伤的损伤是指正常是指正常DNADNA分子的化学结构或物理结构在某些物理、分子的化学结构或物理结构在某些物理、化学因素（如射线和化学试剂）以及细胞自发产生的基因毒素等化学因素（如射线和化学试剂）以及细胞自发产生的基因毒素等干扰作用下发生改变的现象。干扰作用下发生改变的现象。（P221P221）（一）物理因素（一）物理因素 如如电离辐射电离辐射：使链的断裂、碱基及五碳糖的损伤。：使链的断裂

24、、碱基及五碳糖的损伤。紫外照射紫外照射（254nm）：使：使DNA分子的相邻的分子的相邻的2个个T形成二聚体（环丁基二形成二聚体（环丁基二聚体）；聚体）；（二）化学因素（二）化学因素 1.1.烷基化烷基化 2.2.亚硝基亚硝基 3.3.碱基类似物碱基类似物 4.4.吖啶类分子，如吖啶类分子，如EB EB （三）自发性损伤（三）自发性损伤 1. 1. 脱嘌呤和脱嘧啶脱嘌呤和脱嘧啶(AP(AP位点的产生位点的产生) )2. 2. 碱基的脱氨基作用碱基的脱氨基作用3. 3. 碱基的互变异构碱基的互变异构4. 4. 细胞正常代谢产物对细胞正常代谢产物对DNADNA的损伤的损伤二、二、DNADNA的损伤

25、修复的损伤修复（一）错配修复（一）错配修复1. 1. 模板区分机制模板区分机制催化酶：催化酶：DamDam甲基化酶甲基化酶 发生时制：发生时制：DNADNA复制后的复制后的一段时间内（约几秒或一段时间内（约几秒或几分钟）几分钟） 发生部位：发生部位：GATCGATC中腺嘌中腺嘌呤呤N N 6 6的位置均可以发生的位置均可以发生甲基化甲基化 。2. 2. 修复位点的识别修复位点的识别 MutSMutS结合在错配位点，结合在错配位点， MutHMutH结合于结合于GATCGATC顺序；顺序； MutLMutL可以与可以与MutSMutS形成复形成复合物，并与合物，并与MutHMutH结合，结合，

26、在错配碱基两边的在错配碱基两边的DNADNA链沿链沿着复合物的移动是等速，着复合物的移动是等速， 穿过穿过MutLMutSMutLMutS复合物产复合物产生一个生一个DNADNA环，直到复合物环，直到复合物碰上甲基化的碰上甲基化的GATCGATC顺序。顺序。 MutHMutH催化切断催化切断GATCGATC顺序顺序G G碱碱基基5 5一边的未甲基化链，一边的未甲基化链，给该修复的链作上记号。给该修复的链作上记号。 3. 3. 修复的切割与聚合修复的切割与聚合 (1) (1) 当错配点在切点当错配点在切点5 5 端时，去甲基化以端时，去甲基化以3 3 55 方向降解（从方向降解（从切点切点错配点

27、）。错配点）。 这个过程要有：这个过程要有： DNADNA解螺旋酶解螺旋酶、 SSBSSB、 外切酶外切酶或或（由（由3 355方向降解）、方向降解）、 DNADNA聚合酶聚合酶、 DNADNA连接酶。连接酶。 (2) (2) 错配点在切点错配点在切点3 3 端一边时，修复途径类似。端一边时，修复途径类似。 外切酶外切酶（5 5 33 或或3 3 55 方向降解）、方向降解）、 或或RecJRecJ蛋白（蛋白（5 5 33 方向降解单链方向降解单链DNA DNA ）。）。 （二）（二）切除修复（切除修复（excision repair） 1. 1. 碱基切割修复碱基切割修复（base exci

28、sion repairbase excision repair）（1 1）由细胞内一类特异的）由细胞内一类特异的DNADNA糖糖苷酶（苷酶（glycosylaseglycosylase）识别）识别DNADNA中中不正常的碱基，并将其水解下来，不正常的碱基，并将其水解下来，形成形成APAP位点。位点。 （2 2）APAP核酸内切酶在核酸内切酶在APAP位点附近位点附近将将DNADNA链切开。（不同链切开。（不同APAP核酸内切核酸内切酶的作用方式不同，或是在酶的作用方式不同，或是在5 5 侧切侧切开，或是在开，或是在3 3 侧切开）。侧切开）。 （3 3）核酸外切酶将包括）核酸外切酶将包括APA

29、P位点在位点在内的内的DNADNA链切除。链切除。 （4 4）DNADNA聚合酶聚合酶兼有外切酶活性，兼有外切酶活性，并使并使DNADNA链链3 3 端延伸以填补空缺，端延伸以填补空缺，DNADNA连接酶将连上。连接酶将连上。 APAP位点的产生位点的产生2.2.核苷酸切除修复（核苷酸切除修复（nucleotide-excision repairnucleotide-excision repair） 切除酶（切除酶（excinucleaseexcinuclease）也是一种核酸内切酶，但与一般的核酸）也是一种核酸内切酶，但与一般的核酸内切酶不同，在链的损伤两侧同时切开。编码此酶的基因是内切酶不

30、同，在链的损伤两侧同时切开。编码此酶的基因是UvrUvr基因。基因。 大肠杆菌中大肠杆菌中ABCABC切除酶催化过程：切除酶催化过程： UvrAUvrA和和UvrBUvrB复合物（复合物（A A2 2B B）寻找并结合到损伤部位。寻找并结合到损伤部位。UvrAUvrA离解，离解，UvrBUvrB与与DNADNA牢固结合。牢固结合。 UvrCUvrC蛋白结合到蛋白结合到UvrBUvrB，UvrBUvrB切开切开损伤部位损伤部位3 3 端第端第5 5个磷酸二酯键，个磷酸二酯键，UvrCUvrC切开切开5 5 侧第侧第8 8个磷酸二酯键。个磷酸二酯键。 UvrDUvrD解螺旋酶帮助除去。解螺旋酶帮助

31、除去。 空缺由空缺由DNADNA聚合酶聚合酶和连接酶填补。和连接酶填补。 （三）（三）直接修复（直接修复（direct repair） 直接修复直接修复是指不需要移去任何碱基或核苷酸就可以将损伤逆是指不需要移去任何碱基或核苷酸就可以将损伤逆转到正常状态的修复机制。转到正常状态的修复机制。（P229P229）1. 1. 光复活修复（光复活修复（potoreactivation repairpotoreactivation repair） 2. O2. O6 6甲基鸟嘌呤的修复甲基鸟嘌呤的修复 光复活光复活(photoreactivation)(photoreactivation)是在可见光是在可见光(300(300600nm)600nm)的活化之的活化之下，光复活酶下，光复活酶(photoreactivating enzyme(photoreactivating enzyme，PR)PR)，或称光敏裂，或称光敏裂合酶合酶(photolyase)(photolyase)，催化嘧啶二聚体分解成为单体的过程。，催化嘧啶二聚体分解成为单体的过程。 光复活酶在生物界分布很广，从低等单细胞生物一直到鸟类都有。光复活酶在生物界分布很广，从低等单细胞生物一直到鸟类都有。 在烷基化作用下，碱基可被烷基化，使在烷基化作用下，碱基可被烷基化，使GCGC对变为对变为G GT T，易突变，易突变为为A