ELISA的原理与应用

1、酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA ）技术讲座技术讲座一、免疫检测的基础知识一、免疫检测的基础知识二、二、ELISAELISA的基本知识的基本知识三、本次三、本次ELISAELISA实验操作解读实验操作解读1抗原抗原抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体引起细胞免疫和产生抗原进入机体后，可刺激机体引起细胞免疫和产生抗体。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量抗体。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于大于5000的蛋白质，例如完整的病毒粒子

2、、细菌的蛋白质，例如完整的病毒粒子、细菌等。小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起等。小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原。例如某些激机体产生特异性抗体的，称为半抗原。例如某些激素、药物等。抗原的反应性取决于抗原决定簇，或素、药物等。抗原的反应性取决于抗原决定簇，或称为表位。一个抗原分子可带有不同的决定簇，例称为表位。一个抗原分子可带有不同的决定簇，例如细菌的荚膜多糖、类脂中可带有多个抗原决定簇。如细菌的荚膜多糖、类脂中可带有多个抗原决定簇。2抗体抗体抗体的结构抗体的结构抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immuno

3、globulin,Ig)。Ig分五类，即分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和和IgE。与免疫测定有关的。与免疫测定有关的Ig主要为主要为IgG和和IgM。Ig由两个轻链（由两个轻链（L）和两个重链（）和两个重链（H）的单体组成。）的单体组成。Ig的的轻链是相同的，有轻链是相同的，有（kappa）和）和（Lambda）两种）两种型别。型别。 五类五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。也不同。IgG和和IgM的重链分别称为的重链分别称为（gamma）链）链和和（mu）链。）链。重链和轻链的重链和轻链的N端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，端的氨

4、基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用称为可变区，分别用VH和和VL表示。两者构成抗体的抗表示。两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合（见图），是抗体专一性结合性结合（见图），是抗体专一性结合抗原的结构基础。抗原的结构基础。 机体被微生物感染后，先产生机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生抗体，然后产生IgG抗体。经过一段时间，抗体。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，抗体量逐渐减少而消失，而而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。1.11.

5、1抗原抗体反应抗原抗体反应 1.1.11.1.1可逆性可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：平衡，其反应式为：Ag+AbAgAbAg+AbAgAb 抗体的亲和力（抗体的亲和力（affinityaffinity），可以用平衡常数），可以用平衡常数K K表示：表示：K=AgAbK=AgAbAgAb ,AgAbAgAb ,AgAb的解离程度与的解离程度与K K值有关。值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。非常适合，

6、两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。体均能保持原有的结构和活性。1.1.21.1.2特异性特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。1.1.31.1.3最适比例最适比例 在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图。曲线在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图。曲

7、线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带。在等价带前后分别为的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中称为带现象。抗体过量称为前带，抗原地过量称为后带。在用免疫学疫测定中称为带现象。抗体过量称为前带，抗原地过量称为后带。在用免疫学方法测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际方法测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。含量，甚至出现假阴性。1.1.4

8、1.1.4敏感性敏感性化学比色法的敏感度为化学比色法的敏感度为mg/mlmg/ml水平水平酶反应测定法的敏感度约为酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/mlng/ml水平水平例如：用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定口蹄疫抗体，其敏感度可达例如：用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定口蹄疫抗体，其敏感度可达0.1ng/ml。1.21.2免疫测定在临床检验中的应用免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子

9、的半抗原，均可用以制备特由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。1) 体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质。体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质。2) 激素，包括小分子量的甾体激素等。激素，包括小分子量的甾体激素等。3) 抗生素和药物。抗生素和药物。4) 病原体抗原，如胶体金测禽流感病毒。病原体抗原，如胶体金测禽流感病毒。5) 另外，也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体。另外，也可利

10、用纯化的抗原检测标本中的抗体。免疫标记技术免疫标记技术定义：定义： 将抗原将抗原- -抗体反应与标记技术相结合，用抗体反应与标记技术相结合，用放射性同放射性同位素、酶或荧光素位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：分类： 放射免疫测定法：放射免疫测定法：131131I I，3232P P 免疫荧光技术：免疫荧光技术：FITCFITC，PEPE 免疫酶测定法：免疫酶测定法：HRPHRP，APAP免疫酶测定法免疫酶测定法酶标抗体技术 酶分子与抗原或抗体分子共价结合 酶标抗体与存在于组织细胞

11、或吸附于固相载体上的抗原（抗体）发生特异性结合，并洗下未结合的物质。 滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色。可根据颜色反应来判定有无相应的免疫反应。 颜色反应的深浅与标本中相应抗原（抗体）的量成正比。 此种有色产物可用肉眼或分光光度计加以测定。酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。未知抗体或抗原的方法。将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体检测液相中未知抗体将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中

12、的可溶性抗原检测液相中的可溶性抗原将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体1. 1. ELISA的原理的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。又保留酶的活性。 在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固在测定时，受检标

13、本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。 再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。一定的比例。 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈产物的量与标本中受

14、检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。色的深浅进行定性或定量分析。酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（以间接性（以间接性ELISAELISA为例）为例）：3. ELISA3. ELISA的试剂的试剂(A(A、B B、C C三部分三部分) )ELISAELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。底物。（1 1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2 2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3 3）酶的底物；）酶的底物；（4 4）阴性对照品和

15、阳性对照品，参考标准品；）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5 5）结合物及标本的稀释液；）结合物及标本的稀释液；（6 6）洗涤液；）洗涤液；（7 7）酶反应终止液）酶反应终止液ELISAELISA的试剂准备的试剂准备A A 固相载体固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。但空白值也略高。 良好的良好的ELISAELISA板应该是板应

16、该是吸附性能好吸附性能好，空白值低空白值低，孔底透明孔底透明度高度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相性能相近近。3.1.2 3.1.2 包被的方式包被的方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)(coating)。 蛋白质蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子团间的作用。这种物理吸附是非特异

17、性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的通常含有更多的疏水基团疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。，故更易吸附到固相载体表面。不易吸附不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。较多的抗原也可采用捕获包被法。亲和素生物素亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的即用亲和素先包被载体，加入生物素化的D

18、NADNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。量测定。脂类物质脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入）中溶解后加入ELISAELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。 优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的佳。抗原用量少，仅为直接包被的

19、1/101/10乃至于乃至于/100/100。包被用抗原：包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。的吸附，间接地结合到固相载体表面。3.1.4 3.1.4 包被用抗体包被用抗体I

20、gGIgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在FcFc段上，抗体结合段上，抗体结合点暴露于外。点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液. .须除去杂抗体后才能须除去杂抗体后才能用于用于ELISAELISA，以保证试验的特异性。，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。，可取得更好的效果。3.1.5 3.1.5 包被的条

21、件包被的条件pH9.6pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液pH7.2pH7.2的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液pH7-8pH7-8的的Tris-HCLTris-HCL缓冲液。缓冲液。 加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置过夜，冰箱中放置过夜，3737中保温中保温2 2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。3.1.6 3.1.6 封

22、闭封闭封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥空隙，从而排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：常用封闭剂：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明胶明胶; ;脱脂奶粉脱脂奶粉, ,比较价廉，可以高浓度使用（比较价廉，可以高浓度使用（5%5%）。）。 3.4 3.4 洗涤液洗涤液在板

23、式在板式ELISAELISA中，常用的稀释液为含中，常用的稀释液为含0.05%0.05%吐温吐温2020磷磷酸盐缓冲液。酸盐缓冲液。ELISA的试剂准备的试剂准备B 3.2 3.2 结合物结合物 即酶标记的抗体（或抗原）是即酶标记的抗体（或抗原）是ELISAELISA中关键的试剂中关键的试剂 1 1 酶的催化活性酶的催化活性 2 2抗体（或抗原）的免疫活性抗体（或抗原）的免疫活性 3 3结合物尚要有良好的稳定性。结合物尚要有良好的稳定性。3.2.1 3.2.1 结合物用的抗原和抗体结合物用的抗原和抗体 制备结合物时所用纯度较高的制备结合物时所用纯度较高的IgGIgG，以免在与酶联结时其，以免在

24、与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在实验结果本底浅淡。在ELISAELISA中用酶标抗原的模式不多，总中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。的要求是抗原必须是高纯度的。3.2.23.2.2酶酶纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。酶结合物

25、保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。价格低廉，有色产物易于测定等。在在ELISAELISA中，中，HRPHRP，APAP，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，-D-D-半乳糖苷酶和半乳糖苷酶和脲酶等。脲酶等。HRPHRP是一种糖蛋白，含糖量约为是一种糖蛋白，含糖量约为18%18%，分子量为，分子量为4400044000，是一，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。成，是一种卟啉蛋白质。3.2.3 3.2.3 结合物的制备结

26、合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。盐氧化法。（1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达60%-70%60%-70%）和重）和重复性好。复性好。 交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。（2 2）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸

27、钠将）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRPHRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成成chiffchiff氏碱而结合。简便有效氏碱而结合。简便有效. . 结合物中混有的游离酶一般不影响结合物中混有的游离酶一般不影响ELISAELISA中最后的酶活性测中最后的酶活性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。测，效果更好。 制得结合物，

28、最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。到最合适的测定条件和测定费用的节省。3.2.43.2.4结合物的保存结合物的保存 酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生

29、素（例如庆大霉素）和防腐剂（例如庆大霉素）和防腐剂（HRPHRP结合物加硫柳泵，结合物加硫柳泵，APAP结结合物可加叠氮钠）。合物可加叠氮钠）。3.2.5 3.2.5 结合物的稀释液结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：反应中直接吸附在固相载体上：0.1%0.1%牛血清白蛋白，牛血清白蛋白， 0.05%0.05%吐温吐温20 20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在使用时不需再行稀释，在4-84-8保存期可达保存期可达6 6个

30、月。个月。试剂准备试剂准备 C 酶的底物酶的底物3.3 3.3 酶的底物酶的底物3.3.1 3.3.1 HRPHRP的底物的底物OPDOPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm492nm处处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRPHRP结合物最常用的结合物最常用的底物。底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2为供氢体，为供氢体， H2O2为受氢体。为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺如：

31、邻苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS 。ETMBTMB经经HRPHRP作用后共产物显蓝色。作用后共产物显蓝色。TMBTMB性质较稳定，可配成溶液性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与试剂，只需与H H2 2O O2 2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMBTMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm450nm。ABTSABTS虽不如虽不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒

32、所采用。所采用。HRPHRP对氢受体的专一性很高，仅作用于对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2H2O2、小分醇的过氧化、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物物和尿素过氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。 APAP的底物为磷酸酯酶，一般采用对的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯作为作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm405nm波长处有吸波长处有吸收峰。用收峰。用NaOHNaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。终止酶反应后，黄色可稳定一时间。APAP也有发荧光底物（磷酸也有发荧光底物（磷酸4-4-甲基伞酮），可用于甲

33、基伞酮），可用于ELISAELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。3.5 3.5 酶反应终止液酶反应终止液常用的常用的HRPHRP反应终止液为硫酸，其浓度按反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISAELISA中一般采用中一般采用2mol/L2mol/L。4 4 对照设定对照设定 阳性对照品阳性对照品(positive control)(positive control)和阴性对照品和阴性对照品(negative (negative control)control)是检验试验有

34、效性的控制品，同时也作为判断结果是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。的对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称；加入的量应与试剂的敏感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。质的量。参考标准品参考标准品 定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖

35、可检测范围的标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-54-5个个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中. .阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAgHBsAg检测的阴检测的阴性对照品中不可含性对照品中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是阴性。也是阴性。 标本的采取和保存标本的采取和保存 体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。抗原成份。以血清标本为例：血浆中除尚含有以血清标本为例：血

36、浆中除尚含有纤维蛋白原纤维蛋白原和和抗凝剂抗凝剂外，外，其他成份同血清。血浆和血清可同等应用。其他成份同血清。血浆和血清可同等应用。血清标本应避免溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧化物血清标本应避免溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以酶活性的物质，以HRPHRP为标记的为标记的ELISAELISA测定中，可能会增加非测定中，可能会增加非特异性显色。特异性显色。基本操作注意事项基本操作注意事项 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。试剂。 ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高

37、质量的。自配的缓冲液应用涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH 计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。放回冰箱保存。 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚，即加标本，加酶结合次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在物，加底物。加样时应将所加物加在LEISALEISA板孔的底部，避板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生

38、气泡。加样加样: :保温保温抗原抗体完成反应的保温过程称为温育抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)(incubation)。ELISAELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。为什么生。为什么ELISAELISA反应总是需要一定时间的温育？反应总是需要一定时间的温育？温育常采用的温度有温育常采用的温度有4343、3737、室温和、室温和44（冰箱温度）等（冰箱温度）等。3737是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。合的合适温度。保温方式：

39、保温方式：ELISAELISA仪器附有特制的电热块，水浴。仪器附有特制的电热块，水浴。若用保温箱：若用保温箱：ELISAELISA板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最后将后将ELISAELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指，标准室温温度是指20-2520-25，但具体操作时可根据说明书，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。应注意温育的温度和

40、时间应按规定力求准的要求控制温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。时测定。洗涤洗涤洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。的成败。ELSIAELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗

41、涤时又应把聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在可以说在ELISAELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。操作中，洗涤是最主要的关键技术。洗涤的方式除某些洗涤的方式除某些ELISAELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有工操作有流水冲洗式和流水冲洗式和浸泡式两种：浸泡式两种：（1 1）流水冲洗式）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效

42、果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。 （2 2）浸泡式）浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性疏水性的，的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。复到水溶液状态，从而脱离固相载体。显色显色显色

43、是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。温度有助于加速显色进行。TMBTMB受光照的影响。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的受光照的影响。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。适当时间阅读结果。TMBTMB经经HRPHRP作用后，约作用后，约4040分钟显色达顶峰分钟显色达顶峰，随即逐渐减

44、弱，至，随即逐渐减弱，至2 2小时后即可完全消退至无色。小时后即可完全消退至无色。比色比色拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。 以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然

45、后进行计算。后进行计算。结果以光密度（结果以光密度（oplical densityoplical density，ODOD），现按规定用吸光），现按规定用吸光度（度（absorbenceabsorbence，A A），两者含义相同。通常的表示方法是），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于，将吸收波长写于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收波长为的吸收波长为492nm492nm，表示方法为，表示方法为AA492492nmnm或或ODOD492492nmnm。酶标比色仪酶标比色仪酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISAELISA光度计

46、。针对固光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到数一般可精确到0.0010.001，准确性为，准确性为1%1%，重复性达，重复性达0.5%0.5%。操作时室温宜在操作时室温宜在15-3015-30，使用前先预热仪器，使用前先预热仪器15-3015-30分钟，测分钟，测读结果更稳定。测读读结果更稳定。

47、测读A A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPDOPD用用492nm492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读。波长。有的酶标仪可用双波长式测读。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。6 6 结果判断结果判断 6.1 6.1 定性测定定性测定定性测定的结果判断作出定性测定的结果判断作出“有有”或或“无无”的回答，分别用的回答，分别用“阳性阳性”、“阴性阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。系列稀释后进行试验，呈阳性

48、反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法在间接法和夹心法ELSIAELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法争法ELISAELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。结果判断方法不同，分述于下。A.A.阳性判定值：阳性判定值： （cut-off valuecut-off valu

49、e）一般为阴性对照一般为阴性对照A A值值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。准。B.B.标本标本/ /阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较难保阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（S S）和阴性对照（）和阴性对照（N N）的）的A A值后，计算值后，计算S/NS/N值。值。间接法间接法4. ELISA4. ELISA的操作要点的操作要点严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好

50、的仪器是保证证ELISAELISA必要条件。必要条件。严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。3、本次、本次ELISA实验实验操作解读操作解读 利用合成肽抗原为固相免疫吸附剂来检测血清中因感染利用合成肽抗原为固相免疫吸附剂来检测血清中因感染FMDVFMDV而产生的特异性抗体。此合成肽是一单链复合体，他们具而产生的特异性抗体。此合成肽是一单链复合体，他们具有有FMDV VP1FMDV VP1病毒外壳表面蛋白质特定抗原决定区的氨基酸序列病毒外壳表面蛋白质特定抗原决定区的氨基酸序列及结构，具病毒血清型之特异性。这些合成肽抗原和相应抗体及结构，具病毒血清型之特异性。

51、这些合成肽抗原和相应抗体的结合力极高，因此带给此检验试剂以极高的敏感性。这些代的结合力极高，因此带给此检验试剂以极高的敏感性。这些代表表VP1VP1蛋白质特定区域的合成抗原是经无数次特异性筛选所选蛋白质特定区域的合成抗原是经无数次特异性筛选所选出，因此其特异性亦十分优越。这些长度很短的特定区域合成出，因此其特异性亦十分优越。这些长度很短的特定区域合成抗原不具有对其他非特异性抗体的交叉反应。本产品主要用于抗原不具有对其他非特异性抗体的交叉反应。本产品主要用于评估经评估经FMDVFMDV疫苗免疫后动物的免疫状况。疫苗免疫后动物的免疫状况。 本试剂盒是采用口蹄疫病毒合成肽固相化抗原包被于微孔本试剂盒是采用口蹄疫病毒合成肽固相化抗原包被于微孔板的微孔表面上。这些多肽代表了口蹄疫病毒板的微孔表面上。这些多肽代表了口蹄疫病毒 VP1VP1区中具有高区中具有高度抗原性的蛋白片段。在实验中，在相应的反应孔中加入稀释度抗原性的蛋白片段。在实验中，在相应的反应孔中加入稀释的对照和待检血清，经孵育后，若样品中含有口蹄疫病毒特异的对照和待检血清，经孵育后，若样品中含有口蹄