实验2重组质粒的提取及鉴定2015

1、1实验二重组DNA的提取及酶切鉴定复旦大学基础医学院医学实验教学中心复旦大学基础医学院医学实验教学中心邵红霞邵红 2一、实验目的掌握以下方法和技术：掌握以下方法和技术： 1. 质粒质粒DNA的小量快速制备的小量快速制备 2. 质粒质粒DNA的限制性内切酶酶切的限制性内切酶酶切 3. DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳3二、实验原理 分离质粒分离质粒DNA有三个步骤：有三个步骤：1. 培养细菌使质粒扩增培养细菌使质粒扩增2. 收集和裂解细菌（本实验：收集和裂解细菌（本实验：SDS裂解）裂解）3. 分离和纯化质粒分离和纯化质粒DNA（本实验：碱变性法）（本实验：碱变

2、性法）1. 质粒质粒DNA的小量快速制备的小量快速制备4碱变性法抽提质粒碱变性法抽提质粒DNASolution IIpH12.6Solution IIIpH4.8离心后去向离心后去向染色体染色体DNA氢键断裂，双氢键断裂，双螺旋解开螺旋解开不能复性不能复性沉淀中沉淀中质粒质粒DNA氢键部分断裂，氢键部分断裂，cccDNA互补链互补链不完全分离不完全分离复性复性上清中上清中5硅基质材料硅基质材料(树脂）与树脂）与DNA双链相互作用的原理双链相互作用的原理 DNA分子中的磷酸二酯键骨架在盐溶液的作用下分子中的磷酸二酯键骨架在盐溶液的作用下脱水脱水，使，使得暴露的得暴露的磷酸基团磷酸基团吸附硅胶。双

3、链吸附硅胶。双链DNA分子一旦被硅胶吸分子一旦被硅胶吸附，一般的洗液不能将其洗脱下来，只有水溶性的缓冲液，附，一般的洗液不能将其洗脱下来，只有水溶性的缓冲液，如如TE或水重新或水重新水化水化后，后，DNA才能从层析柱上定量回收。才能从层析柱上定量回收。6 2. 质粒质粒DNA的限制性内切酶酶切的限制性内切酶酶切BamH I + Xba I双酶切（酶切完全时）双酶切（酶切完全时）琼脂糖凝胶电泳凝胶中琼脂糖凝胶电泳凝胶中2条区带条区带3.5kb pSV2载体片段载体片段4.8kb c-myc 目的基因片段目的基因片段pSV-c-mycBamH IXba Ic-myc基因片段基因片段4.8 kbpS

4、V2载体片段载体片段3.5kb7琼脂糖琼脂糖海藻中提取的线状高聚物海藻中提取的线状高聚物 加热融化成清澈、透明的溶液加热融化成清澈、透明的溶液 凝固后成凝胶凝固后成凝胶3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳89DNA在凝胶中的迁移率的影响因素 DNA分子的大小分子的大小 琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度 DNA的构象的构象 所加电压所加电压 嵌入染料的存在嵌入染料的存在 电泳缓冲液的组成及其离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度1011不同含量标准的琼脂糖凝胶的分离范围不同含量标准的琼脂糖凝胶的分离范围琼脂糖凝胶浓度线状琼脂糖凝胶浓度线状 DNA分子分离范围分子分离范围 （%，m/V） （kb） 0.3 5

5、60 0.5 130 0.6 120 0.7 0.812 1.0 0.510 1.2 0.46 1.5 0.24 2.0 0.1312 质粒质粒DNA的的3种构象种构象琼脂糖凝胶电泳凝胶中琼脂糖凝胶电泳凝胶中1、2、3条带都有可能条带都有可能共价闭合环形共价闭合环形DNA开环开环DNA线性线性DNA存在复制中间体可能存在复制中间体可能13DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液141%琼脂糖凝胶电泳中：琼脂糖凝胶电泳中：溴酚蓝迁移速率约与溴酚蓝迁移速率约与300bp的线状双链的线状双链DNA相同；相同；二甲苯氰二甲苯氰FF约与长约与长4000bp的的DNA相同相同增加样品密度，以确保增加样品密度，以确保DN

6、A均匀进入样品孔里均匀进入样品孔里使样品呈现颜色使样品呈现颜色在电场中可预知速率（向阳极涌动的染料）在电场中可预知速率（向阳极涌动的染料）15三、实验器材与试剂（详见实验讲义）16四、实验步骤四、实验步骤（详见实验讲义）（详见实验讲义）1. 质粒质粒DNA的小量快速制备的小量快速制备（AXYGEN AxyPrep质粒质粒DNA小量制备试剂盒小量制备试剂盒）注意事项：注意事项： 1. 首次使用前，将首次使用前，将RNaseA全部加入全部加入Buffer S1中，中，4 贮存贮存 2.首次使用前，首次使用前，Buffer W2 concentrate 中加入指定体积的无水乙醇中加入指定体积的无水乙

7、醇 3. 使用前检查使用前检查Buffer S2是否出现沉淀，若有应在是否出现沉淀，若有应在37加热溶解并冷却加热溶解并冷却至室温使用至室温使用 4. 自行准备无核酸和核酸酶污染的自行准备无核酸和核酸酶污染的tip头和离心管头和离心管 5. Buffer S2使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和中和Buffer S2中中的的NaOH，降低溶菌效率，降低溶菌效率17将细菌培养物全部倒入将细菌培养物全部倒入15ml离心管，离心管，4500rpm，5min加加250 l Buffer S1，吹打混匀（也可，吹打混匀（也可Vortex）以充分悬浮细菌，转入）以充分

8、悬浮细菌，转入1.5ml离心管离心管加加250 l Buffer S2，上下颠倒，温和混匀，上下颠倒，温和混匀46次使菌体裂解次使菌体裂解加加350 l Buffer S3，上下颠倒，温和混匀，上下颠倒，温和混匀68次，次，12000g 离心离心10min吸取上清至已置于吸取上清至已置于 2ml 离心管的制备管中，离心管的制备管中，12000g离心离心1min，弃滤液，弃滤液同上，在制备管中加同上，在制备管中加500 l Buffer W1， 12000g离心离心1min ，弃滤液，弃滤液在制备管中加在制备管中加700 l Buffer W2， 12000g 离心离心1min ，弃，弃滤液，重

9、复以滤液，重复以Buffer W2洗涤（离心）一次，再空离心洗涤（离心）一次，再空离心1次次将制备管移入新的将制备管移入新的1.5ml离心管，在膜中央加离心管，在膜中央加60 l Eluent或去或去离子水，室温静置离子水，室温静置1min， 12000g离心离心1min，即为质粒，即为质粒DNA。避免剧烈摇晃，此步骤不宜超过避免剧烈摇晃，此步骤不宜超过5min避免剧烈摇晃避免剧烈摇晃Eluent液液65度温育可提高洗脱效率度温育可提高洗脱效率请保持同步！请保持同步！离心机配平离心机配平弃上清，沥干，注意细菌沉淀别倒掉了！弃上清，沥干，注意细菌沉淀别倒掉了！182. 质粒质粒DNA的限制性内切

10、酶的双酶切的限制性内切酶的双酶切Buffer 4 2 lBamH(20U/ l) 1 lXba(20 U/ l) 1 ldd H2O 10l质粒质粒DNA 6l 20 l混匀后短暂离心，混匀后短暂离心，37 水浴水浴1小时小时注意：注意：1. 加样顺序加样顺序2. 保证每样试剂加入反应体系保证每样试剂加入反应体系3. 乙酰化乙酰化BSA可不加可不加4. 加样完成后需混匀，短暂离心加样完成后需混匀，短暂离心5. 反应结束反应结束后，上样电泳前需后，上样电泳前需短短暂暂离心，再加凝胶离心，再加凝胶加样缓冲液加样缓冲液6. 及时将酶放回及时将酶放回-20 冰箱以保冰箱以保证酶的活力证酶的活力19准备

11、好制胶器，插好梳子准备好制胶器，插好梳子并保证梳子距底部并保证梳子距底部0.5mm-1.2mm灌胶（事先加灌胶（事先加GelRed）注）注意赶气泡意赶气泡待凝待凝准备好凝胶，加热熔解准备好凝胶，加热熔解20注意事项：注意事项：1. 标液面高度以观察水分是否蒸发标液面高度以观察水分是否蒸发过多，若溶解后水分蒸发过多，过多，若溶解后水分蒸发过多，补水补水2. 三角烧瓶上覆三角烧瓶上覆打过洞打过洞的保鲜膜的保鲜膜（防水蒸发）（防水蒸发）3. 防爆沸和烫伤防爆沸和烫伤（带手套）（带手套）4. 加加6l GelRed后立即灌胶（戴手后立即灌胶（戴手套）套）称量称量agarose加入加入TAE 60ml，

12、勿晃勿晃微波炉溶胶微波炉溶胶注意先做好制胶准备！注意先做好制胶准备！1%agarose凝胶1%agarose凝胶21在电泳槽内加电泳缓冲液在电泳槽内加电泳缓冲液拔去加样梳，将制好的凝拔去加样梳，将制好的凝胶连同内架放入电泳槽内，胶连同内架放入电泳槽内，保证液面高于保证液面高于凝胶面凝胶面加入加入6 凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液和和DNA（1:5比例混合）比例混合）依次加样，并加好依次加样，并加好Marker连通电源，连通电源，80V电泳至溴电泳至溴酚蓝带达到凝胶的酚蓝带达到凝胶的1/2处处结果观察和记录结果观察和记录DNA从阴极向阳极迁移从阴极向阳极迁移EBr从阳极向阴极迁移从阳极向阴极迁移（

13、加样后不能移动电泳槽！）（加样后不能移动电泳槽！）22凝胶成像及分析系统凝胶成像及分析系统233. DNA的的1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳制胶：制胶：1% agarose ，防过热暴沸，防过热暴沸上样准备上样准备 （1份凝胶加样缓冲液加份凝胶加样缓冲液加5份份DNA）上样和电泳上样和电泳: : 每组上样每组上样2个（个（ 未酶解质粒和双酶切产物）未酶解质粒和双酶切产物） 未酶解质粒未酶解质粒10 l +2 l凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液 双酶切产物双酶切产物20 l +4 l凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液 Marker5l, 放中间，放中间，2组组1块胶块胶 各组先做好准备，两组统一集中上样

14、后电泳各组先做好准备，两组统一集中上样后电泳 电泳槽和电泳仪不可移动电泳槽和电泳仪不可移动24 未酶切酶切未酶切酶切Marker10 l+2 l 20 l +4 l10 l+2 l 20 l +4 l5 l4. 结果观察和记录结果观察和记录80100V电泳，直到溴酚蓝带泳动到凝胶的电泳，直到溴酚蓝带泳动到凝胶的1/2至至2/3处处停止。停止。紫外灯下观察，拍照记录。紫外灯下观察，拍照记录。上样图示：上样图示：25预期结果预期结果未酶切质粒对照组双酶切实验组双酶切实验组双酶切对照组双酶切未酶切质粒Marker26未酶切质粒对照组双酶切实验组双酶切DNA/Hind Marker-23130-941

15、6-6557-4361-2027-23221%agarose凝胶电泳27发散性思考：发散性思考：1.1.为何细菌平板上的长出的细菌集合是单克隆（一个细菌为何细菌平板上的长出的细菌集合是单克隆（一个细菌来源）的？请例举可能的解释来支持或反对这一说法。来源）的？请例举可能的解释来支持或反对这一说法。2.2.为何线性的质粒不易转入细菌内，如何从机理上解释，为何线性的质粒不易转入细菌内，如何从机理上解释，从实验中证明？连接时是否会出现多聚体？从实验中证明？连接时是否会出现多聚体？思考与疑问：思考与疑问：1.1. 做感受态时，为何要在冰浴下进行？做感受态时，为何要在冰浴下进行？是否还有其他可能原因是否还有其他可能原因 为了让细胞膜流动性降低，利于为了让细胞膜流动性降低，利于DNADNA的结合，同时使细胞暂停生长，的结合，同时使细胞暂停生长，维持在对数生长期的高活性维持在对数生长期的高活性 全程在冰浴下进行，反复冻融会使细菌细胞破裂全程在冰浴下进行，反复冻融会使细菌细胞破裂2. 2. 为何细菌平板倒过来生长更好？为何细菌平板倒过来生长更好？是否还有其他可能原因是否还有其他可能原因 微生物培养时一般培养基中的水分含量较高，且培养温度一般较高，微生物培养时一般培养基中的水分含量较高，且培养温度一般较高，如果不将培养皿翻转，培养基中的水分会挥发出来，造成培养基中的水如果不将培养皿翻转，