小鼠骨髓染色体制备与观察

1、实验三、小鼠骨髓染色体标本的制备及观察赵兴华 医用生物学教研室 一、实验目的 初步掌握（小鼠）骨髓细胞染色体标本的制备原理和方法 巩固显微镜的操作技术 了解小鼠的染色体形态特征二、实验原理l 染色体是组成细胞核的基本物质，是基因的载体。染色体异常也称染色体发育不全。目前已确认染色体病综合征100余种，智力低下和生长发育迟滞是染色体病的共同特征。l 21三体综合征； 18三体综合征、 猫叫综合征18三体综合征二、实验原理l 染色体标本的观察广泛应用于一些疾病的临床诊断中。例如白血病、恶性血液病等的诊断。l 染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。l 细胞分裂的中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色

2、体观察的最佳时期。 u 骨髓细胞 数量多且分裂旺盛，可直接进行染色体标本的制备。取材方便，操作简单和无需体外培养和无菌操作，是研究小型哺乳动物等染色体的常用方法。人骨髓染色体抽取 怎样才能制备一个好的染色体标本？u 获得大量处于有丝分裂中期的细胞。u 使细胞膜破裂，且染色体能够完整并较分散的释放出来。u秋水仙素处理：秋水仙素溶液可抑制纺锤体的形成，使正在分裂的骨髓细胞停止在细胞分裂中期，积累大量中期分裂相细胞。u低渗作用: 使细胞充分膨胀，减少染色体间的相互缠绕和重叠。u预固定：终止低渗作用，使细胞离心时不易破裂，固定维持细胞形态结构。u高距离滴片：使细胞膜易于破裂，获得中期染色体标本，在显微

3、镜下观察染色体的结构和数量。三、实验器材和试剂 1、器材 蜡盘、手术剪、小镊子、平皿、注射器、10ml离心管、吸管、量筒、预冷载玻片、试管架、离心机、恒温水浴锅、显微镜、香波油、乙醚酒精、擦镜纸 2、试剂 100ug秋水仙素液、 0.075 mol/L KCl 低渗液、 Giemsa染液，固定液（甲醇：乙酸=3:1） 1.秋水仙素处理：选择体重20g左右的小白鼠，按24ug/g(小鼠)秋水仙素，于处死前4h，对其进行腹腔注射100ug/mL秋水仙素液。四、实验步骤 注意：剪去少量骨质，避免骨髓细胞丢失；擦净血迹和肌肉细胞以免影响观察；用0.075 mol/L KCl 收集足量细胞，反复冲洗直到

4、股骨发白。 2.取材：颈椎脱臼法处死 取两后肢股骨 纱布擦净肌肉 剪去股骨两头，暴露骨髓腔 低渗液(5ml)冲洗至离心管内 收集骨髓细胞颈椎脱臼法处死小鼠3. 低渗：用吸管吹打骨髓细胞使其分散，加入预温37的低渗液至8ml,将离心管至37水浴锅中，保温至少30 min后取出，使细胞充分吸水膨胀。 低渗不足，则细胞膨胀不够，滴片时细胞不易破 裂，染色体也不易分散开。 低渗过度，则细胞提前破裂，染色体观察不全。空气吹打法：用吸管橡胶头内的空气混匀液体。4. 预固定：加1ml新配制固定液 混匀 1500r/min，5min 弃上清液。 固定液（甲醇：冰乙酸=3:1）需现配；离心需要配平。 作用：终止

5、低渗；维持细胞的膨胀状态；防止离心破裂5. 固定、制细胞悬液：加固定液5ml 吹打混匀 固定15min 离心1500r/min，5min 弃上清，加固定液 0.20.4ml 吹打成细胞悬液，准备制片使用。 制备细胞悬液时，根据具体情况加固定液，以悬液呈现乳白色为宜。 6. 滴片：冰片倾斜30, 细胞悬液距离玻片15-30cm高，在不重叠位置滴12滴，用口顺着倾斜面吹散细胞，迅速过火焰3-5次进行干燥。 注意：a. 温度、高度、倾斜度 b. 火焰干燥的目的：使固定液迅速挥发，产生四周张力加速细胞破裂，使染色体更好地粘连在载玻片上；不可使载玻片烫手。7.染色：在玻片上滴几滴Giemsa染液并铺匀，

6、染色810min，倒去染液，用自来水缓缓冲洗干净、晾干。（染色盘中进行） 注意：采用平铺的方法8.小鼠染色体观察： 低倍镜、高倍镜下寻找染色体分散的中期分裂相，移至视野中央进行观察。小鼠骨髓染色体小鼠骨髓染色体 10 10小鼠骨髓染色体小鼠骨髓染色体 10 40 数目观察：小鼠2倍体细胞染色体，数目2n=40条。其中19对为常染色体，一对为性染色体，染色体的核型分为4组。雄性 XY, 雌性XX,Y染色体最小。形态特征观察：端着丝粒染色体“U”，“V”。五、注意事项1掌握好秋水仙素的浓度和处理时间；2离心前需要配平；3. 小鼠骨髓要冲洗干净，以收集足够的骨髓细胞；3低渗处理是实验成败的关键，注意低渗时间；4固定液要现配现用，固定要充分；5载玻片要洁净并预冷，滴片要有一定的高度和倾斜度；6. 细胞悬液不能太稀，要呈乳白