原代细胞培养实验

1、原代细胞培养实验原代细胞培养实验指导教师：费晓方指导教师：费晓方20052005年年5 5月月v掌握无菌操作技术。掌握无菌操作技术。v了解小鼠解剖操作技术。了解小鼠解剖操作技术。v了解原代细胞培养的一般方法与步骤。了解原代细胞培养的一般方法与步骤。v了解培养细胞的消化分散。了解培养细胞的消化分散。v了解细胞计数方法。了解细胞计数方法。v了解倒置显微镜的使用。了解倒置显微镜的使用。实验目的和要求：实验目的和要求：实验原理：实验原理：v原代细胞培养原代细胞培养v是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁在人工条件下培养使其生存

2、并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。死亡等生命现象。实验内容：实验内容：v动物的选择：动物的选择： 选择大约一半足孕时间的胚胎，选择大约一半足孕时间的胚胎，1013天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。 每组小鼠胚胎每组小鼠胚胎1个个实验材料：实验材料：v每组的超净台中有以下物品：每组的超净台中有以下物品：v1. 50ml 配制好的配制好的R

3、PMI1640培养液培养液1瓶；瓶；8ml小牛小牛血清（血清（FCS) 1瓶；瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶 1瓶；瓶；PBS(-)1 瓶瓶v2. 100ml灭菌烧杯灭菌烧杯2个；个；v3、50ml离心筒离心筒2个个v4、灭菌培养皿、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶个，细胞培养瓶1个个v4、1ml ，200l移液器各移液器各1支；枪头盒支；枪头盒2个；无菌个；无菌玻璃搅拌棒玻璃搅拌棒1个个v5、细胞计数板、细胞计数板1块；块；v6、灭好菌的镊子、灭好菌的镊子1把，剪刀把，剪刀1把；把；v7、酒精灯、酒精灯1台；台；试验操作步骤：试验操作步骤：v1)胚胎的分离。适用哺乳动物胚胎的分离。适用

4、哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠仓鼠、小鼠和大鼠)v a采用认可的方案处死啮齿动物。采用认可的方案处死啮齿动物。 v b立即在无菌超净台内用立即在无菌超净台内用70乙醇擦洗整个动物。乙醇擦洗整个动物。v c用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。无菌镊子将皮肤扯向后腿。v d用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。子宫，置于无菌的培养皿上。v e剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的的100

5、ml烧杯中。烧杯中。v f漂洗胚胎，去掉漂洗胚胎，去掉PBS。继续用。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。液清亮为止。v2)将将12个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎，无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用用PBS漂洗。漂洗。v3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离的无菌离心筒中心筒中, 加入加入40ml 0.25的无菌胰蛋白酶的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻用搅拌棒轻轻搅动搅动 。v4)在温暖的环境中或置于在温暖的环境中或置于37 C培养箱中轻轻摇动培养箱中轻轻摇动1

6、5分分钟。钟。v5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照的离心管中，该管内按照每每10ml上清加入上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。胰蛋白酶。v6)6)加人新鲜胰蛋白酶溶液加人新鲜胰蛋白酶溶液( (见前述步骤见前述步骤) )于含有残留未消化组于含有残留未消化组织块的原来的织块的原来的50ml50ml离心筒中，重复步骤离心筒中，重复步骤4 4和和5 5。v7)7)离心混合的细胞悬液，离心混合的细胞悬液，1200r1

7、200rrainrain，5 5分钟，弃上清。分钟，弃上清。v8)8)用新鲜的无菌用新鲜的无菌PBSPBS重悬沉淀的细胞，按步骤重悬沉淀的细胞，按步骤7 7再次离心。再次离心。v9)9)用用PBSPBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。反复洗涤细胞直至上清清亮为止。v10)10)用含有用含有1010牛血清和抗生素牛血清和抗生素( (如青霉素、链霉素如青霉素、链霉素) )的的DMEM(GIBCODMEM(GIBCOBRL)lOmlBRL)lOml再悬沉淀，并使终体积为再悬沉淀，并使终体积为20ml20ml。v11)11)让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。用数层无菌纱布过滤细胞悬液