受体研究技术

1、Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 受体研究技术受体研究技术Techniques in receptor research Techniques in receptor research 主要参考书主要参考书:受体研究技术受体研究技术 主编主编:贺师鹏贺师鹏, 胡雅儿胡雅儿, 夏宗勤夏宗勤 2004年年4月第一版月第一版课件地址课件地址:生物物理学系生物

2、大分子复合物实验室生物物理学系生物大分子复合物实验室: http:/ Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 第六章第六章 受体放射配基结合分析的基本方法受体放射配基结合分析的基本方法韦日生韦日生北京大学医学部生物物理学系北京大学医学部生物物理学系2006年年6月月Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic M

3、edical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 放射性核素的几个基本概念放射性核素的几个基本概念放射性配基的制备放射性配基的制备 受体标本的制备受体标本的制备放射配基结合反应放射配基结合反应 受体分析的数据处理受体分析的数据处理 RBA主要内容主要内容Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University Schoo

4、l of Basic Medical science 放射性核素的几个基本概念放射性核素的几个基本概念*核衰变核衰变: 放射线核素自发地发生核内成分或者能态的改变放射线核素自发地发生核内成分或者能态的改变而转变为另一种核素而转变为另一种核素,同时释放出一种或者几种以上的射线同时释放出一种或者几种以上的射线,这个变化过程称为放射性核衰变这个变化过程称为放射性核衰变,简称为核衰变简称为核衰变.衰变衰变- -衰变衰变 + +衰变衰变电子俘获电子俘获(EC)衰变衰变跃迁跃迁五种衰变方式五种衰变方式衰变规律衰变规律:N= No e - t N0为为t0时放射性核素的原子核总数时放射性核素的原子核总数 为

5、衰变常数：即每一放射性原子核在单位时间内发生衰变的几率为衰变常数：即每一放射性原子核在单位时间内发生衰变的几率射线射程短射线射程短,穿透力弱穿透力弱,无无需设置屏障需设置屏障;低能低能-射线射射线射程短程短,无需设置屏障无需设置屏障,如如3H; 高能高能-射线一般用中等密射线一般用中等密度材料如玻璃做屏障度材料如玻璃做屏障; 射射线能量高线能量高,穿透力强穿透力强,需要密需要密度大材料如铅度大材料如铅,铁铁,水泥等做水泥等做屏蔽屏蔽. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Bi

6、ophysics, Peking University School of Basic Medical science 半衰期半衰期 T1/2：指放射性核素的原子核数目减少一半所需的时间指放射性核素的原子核数目减少一半所需的时间根据衰变公式：当根据衰变公式：当t= T1/2时时, N=N0/2 = No e - T1/2 T1/2=ln2/ =0.693/ 放射性核素放射性核素3H14C32P35S99mTc125I131I半衰期半衰期12.33年年5730年年14.28天天87.4天天6.02小时小时60天天8天天常见几种医用放射性核素的半衰期常见几种医用放射性核素的半衰期T1/2 = 0.

7、693/ Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science *放射性活度放射性活度()：单位时间内核的衰变数：单位时间内核的衰变数A=dN / dt A=A0 e - t A= N= 0.693/T1/2 N放射性活度单位及其换算：放射性活度单位及其换算：dps, Bq , Ci1Ci =1 103 mCi = 1 106 Ci = 3.7 1010 Bq =37GB

8、q =3.71010dps = 2.221012 dpm1Bq为放射性核素在为放射性核素在1秒内发生秒内发生1次核衰变次核衰变, 1Bq=1dps单位用单位用dps表示表示: 即每秒衰变次数即每秒衰变次数(Disintegrations Per Second ) Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 放射性比活度放射性比活度 : 指单位质量放射性物质的放射

9、性活度可用指单位质量放射性物质的放射性活度可用mCi/mg ，Bq/mg 表示表示也可用每毫摩尔分子所含的放射性活度表示也可用每毫摩尔分子所含的放射性活度表示mCi/mmol ，Bq/mmol每每mol放射性活度为放射性活度为: A= 0.693/T1/2 1 6.022 1023 TBq (1Bq=1dps)T1/2: 单位单位 秒秒; dps: 每秒衰变次数每秒衰变次数1 dps60 = 1dpm1Ci = 3.71010Bq = 2.221012 dpm=3.71010dpsDept.of Biophysics, Peking University School of Basic Med

10、ical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 放射性比活度计算举例：放射性比活度计算举例：核反应生产的核反应生产的 32(T1/2=14.28天，原子量天，原子量=32)那么：那么： 每每mol放射性活度为放射性活度为:A=1 6.022 102336002428.14693. 0= 3.38 1017 dps = 3.38 1017 Bq每克放射性活度为每克放射性活度为: A= 3.38 1017 /32=1.05 1016Bq Dept.of Biophysics, Pe

11、king University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 第六章第六章 受体放射配基结合分析的基本方法受体放射配基结合分析的基本方法第一节放射性配基的制备第一节放射性配基的制备 一放射性配基的基本性质和选择一放射性配基的基本性质和选择 放射性配基的基本要求放射性配基的基本要求比活度高比活度高亲和力高亲和力高特异性高特异性高 稳定性好稳定性好 Dept.of Biophysics, Peking University S

12、chool of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 比活度比活度高高*低比活度标记配基难于达到分析灵敏度的要求。低比活度标记配基难于达到分析灵敏度的要求。 组织细胞内的受体浓度一般都很低，约在组织细胞内的受体浓度一般都很低，约在104-105个个/细胞，细胞，受体的平衡解离常数多在受体的平衡解离常数多在0.110nmol/L间。故一般要求间。故一般要求放射配基比活度至少为放射配基比活度至少为3.71011Bq (10Ci)/mmol。*另外，放射

13、性配基比活度高，加入反应管的放射性配基另外，放射性配基比活度高，加入反应管的放射性配基的化学量就可减少，有利于降低非特异性结合。的化学量就可减少，有利于降低非特异性结合。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 亲和力高亲和力高 *如果配基和受体的亲和力较低，必须用较多的配基如果配基和受体的亲和力较低，必须用较多的配基才能达到基本饱和，不仅会提高非特异结合，

14、而且费才能达到基本饱和，不仅会提高非特异结合，而且费用会大大增加。用会大大增加。 *此外，亲和力高则配基与受体的复合物解离就慢，此外，亲和力高则配基与受体的复合物解离就慢，可进行有效的结合和游离标记配基的分离，有利于减可进行有效的结合和游离标记配基的分离，有利于减少实验误差。少实验误差。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 特异性高特异性高 一般都应选择

15、专一性高的标记配基。如果配基与受一般都应选择专一性高的标记配基。如果配基与受体结合的特异性不高，可能与其它受体有交叉结合，体结合的特异性不高，可能与其它受体有交叉结合，影响结果的可靠性，有时甚至必须用一定方法抑制交影响结果的可靠性，有时甚至必须用一定方法抑制交叉结合才能得到可信的结果。叉结合才能得到可信的结果。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 稳定性

16、好稳定性好所谓稳定性好有两重含义所谓稳定性好有两重含义: 首先是标记原子引入配基分子应当不影响配基的性质，首先是标记原子引入配基分子应当不影响配基的性质，也就是标记配基能代表非标记配基也就是标记配基能代表非标记配基. 其次，标记的配基应当稳定性好，还应定期考察标记其次，标记的配基应当稳定性好，还应定期考察标记配基贮藏过程中的辐射自分解，需要时进行纯化。比活配基贮藏过程中的辐射自分解，需要时进行纯化。比活度太高的度太高的3H标记配基容易发生辐射自分解，应当根据工标记配基容易发生辐射自分解，应当根据工作需要作需要,在要求的灵敏度和减少辐射自分解之间进行合理在要求的灵敏度和减少辐射自分解之间进行合理

17、的选择的选择 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 2 具体工作中标记配基的选择具体工作中标记配基的选择 根据研究对象和研究目的综合考虑根据研究对象和研究目的综合考虑 例如例如: (1)对同一种受体的不同亚型，有的配基有选择性，有的对同一种受体的不同亚型，有的配基有选择性，有的没有选择性，如果实验目的是测定总的受体，应当选没有没有选择性，如果实验目的是测定

18、总的受体，应当选没有选择性的标记配基。如果要分别测定不同亚型，则应考虑选择性的标记配基。如果要分别测定不同亚型，则应考虑用选择性标记配基。用选择性标记配基。 (2)标记配基有水溶性和脂溶性之分，如果测定完整细胞标记配基有水溶性和脂溶性之分，如果测定完整细胞表面的受体，应当选用水溶性标记配基，以减少因配基进表面的受体，应当选用水溶性标记配基，以减少因配基进入胞浆引起的误差。入胞浆引起的误差。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking Univer

19、sity School of Basic Medical science 二二 125I标记放射性配基的制备标记放射性配基的制备 受体放射分析中常用的放射性核素是受体放射分析中常用的放射性核素是3H和和125I。3H标记配基一般都是商品，普通实验室不能自行制备。标记配基一般都是商品，普通实验室不能自行制备。此处主要介绍此处主要介绍125I标记多肽或蛋白的技术标记多肽或蛋白的技术. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University

20、School of Basic Medical science 125I标记放射性配基标记放射性配基 *凡是多肽或蛋白中含有酪氨酸残基的都可引入放射性碘凡是多肽或蛋白中含有酪氨酸残基的都可引入放射性碘. *最常用的核素是最常用的核素是125I，它的半衰期为，它的半衰期为60.2天，最大的放射天，最大的放射性比活度为性比活度为2175Ci/mmol，以核外电子俘获的方式衰变，以核外电子俘获的方式衰变，主要发射低能量主要发射低能量X和和 线。线。 *蛋白质的碘标技术比较成熟，操作简便，一般生物学工蛋白质的碘标技术比较成熟，操作简便，一般生物学工作者均可自行操作。作者均可自行操作。 Dept.of

21、Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science *避免氧化剂引起配基结合活性和生物活性丢失的问题避免氧化剂引起配基结合活性和生物活性丢失的问题 碘标记技术是利用氧化剂将负碘离子氧化为碘分子，碘分子碘标记技术是利用氧化剂将负碘离子氧化为碘分子，碘分子自行分裂成正碘和负碘离子，正碘离子便置换酪氨酸分子中自行分裂成正碘和负碘离子，正碘离子便置换酪氨酸分子中酚酚羟基邻位氢羟基邻位氢而生成放

22、射性碘标记的酪氨酸残基。而生成放射性碘标记的酪氨酸残基。 最常用的氧化剂是氯胺最常用的氧化剂是氯胺-T, 乳过氧气化物酶乳过氧气化物酶-过氧化氢，氯甘脲过氧化氢，氯甘脲 (Iodogen) 等三种等三种 配基结合活性和生物活性丢失主要的原因是多肽分子中的甲配基结合活性和生物活性丢失主要的原因是多肽分子中的甲硫氨酸、半胱氨酸对氧化剂十分敏感，使甲硫氨酸中的硫原子硫氨酸、半胱氨酸对氧化剂十分敏感，使甲硫氨酸中的硫原子氧化成亚砜基团，半胱氨酸则可能形成二硫键。氧化成亚砜基团，半胱氨酸则可能形成二硫键。 (一一) 125I标记放射性配基的几个共同性问题标记放射性配基的几个共同性问题Dept.of Bi

23、ophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science * 碘标记位置不同对配基结合活性和亲和力的影响碘标记位置不同对配基结合活性和亲和力的影响 利用放射性碘标记多肽或蛋白分子属于非同位素标记，酪氨酸利用放射性碘标记多肽或蛋白分子属于非同位素标记，酪氨酸残基酚羟基邻位有两个氢原子都可被置换，生成一碘标记物，残基酚羟基邻位有两个氢原子都可被置换，生成一碘标记物，双碘标记物，往往一碘标记物是有效的

24、，双碘标记物无效双碘标记物，往往一碘标记物是有效的，双碘标记物无效. 一个多肽分子可能存在一个以上的酪氨酸残基，不同位置的一个多肽分子可能存在一个以上的酪氨酸残基，不同位置的酪氨酸残基它的配基结合亲和性是不同的，例如：胰高血糖素酪氨酸残基它的配基结合亲和性是不同的，例如：胰高血糖素（glucagon）虽都是一碘标记物，但因碘标位置不同，不但结）虽都是一碘标记物，但因碘标位置不同，不但结合活性不一样，而且亲和力也不同，合活性不一样，而且亲和力也不同，125I-Tyr13-标记物和标记物和125I-Tyr10-标记物对肝细胞受体的标记物对肝细胞受体的Kd值分别是值分别是1.3nmol/L和和0.3

25、nmol/L，两者相差四倍。，两者相差四倍。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science * 碘标记后由于标记配基衰变造成配基结合活性的改变碘标记后由于标记配基衰变造成配基结合活性的改变 对受体的测定来说，由于要依靠标记配基的比活度来计对受体的测定来说，由于要依靠标记配基的比活度来计算受体的数量和亲和力，所以配基的比活度必需准确标定算受体的数量和亲和力，所以配基

26、的比活度必需准确标定. 对对125I标记的配基，需要考虑储存引起的衰变以及衰变后标记的配基，需要考虑储存引起的衰变以及衰变后是否仍有和受体结合的活性。是否仍有和受体结合的活性。 有些标记配基衰变可能导致化合物某些键的断裂，结果有些标记配基衰变可能导致化合物某些键的断裂，结果衰变产物失去和受体结合的能力，如某些小分子标记配基。衰变产物失去和受体结合的能力，如某些小分子标记配基。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University Sc

27、hool of Basic Medical science (二二) 几种常用的碘标技术几种常用的碘标技术* 氯胺氯胺-T法法* Iodogen法法 * 乳过氧化物酶法乳过氧化物酶法 * 偶联标记法偶联标记法Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 氯胺氯胺-T 法法氯胺氯胺-T的化学名称为的化学名称为N-氯代甲苯磺酰胺钠盐氯代甲苯磺酰胺钠盐,迄今仍然是实验室

28、迄今仍然是实验室最常用的碘化方法之一。最常用的碘化方法之一。 氧化原理氧化原理:氯胺氯胺-T 次氯酸次氯酸 水解水解碘阴离子碘阴离子氧化氧化碘分子碘分子 负碘离子负碘离子正碘离子正碘离子裂解裂解与酪氨酸分子中酚基邻位氢置换与酪氨酸分子中酚基邻位氢置换 生成放射性碘标记的酪氨酸残基生成放射性碘标记的酪氨酸残基Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 氯胺氯胺-T

29、法法 (N-氯代甲苯磺酰胺钠盐氯代甲苯磺酰胺钠盐 ) 注意事项注意事项 1 氧化剂的用量氧化剂的用量 如理论上氧化如理论上氧化1 mCi (0.46纳克原子数纳克原子数) 无载体，无保护剂的无载体，无保护剂的Na125I理论上只要用理论上只要用0.075 g氯胺氯胺-T. 实际用量都要大实际用量都要大.过量的氯胺过量的氯胺-T使反应彻底快速完成，使反应彻底快速完成，其次如果碘源含保护剂其次如果碘源含保护剂(Na2SO3)，还要加，还要加35倍的氯胺倍的氯胺-T氧化还原剂氧化还原剂. 所以氯胺所以氯胺-T用量为用量为10-20 g比较合适比较合适 .Dept.of Biophysics, Pek

30、ing University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 2 碘化反应完成后，还需加碘化反应完成后，还需加1.52倍的还原剂偏重亚硫倍的还原剂偏重亚硫酸钠酸钠 (Na2S2O5) 中和多余的氯氨中和多余的氯氨-T。 3 标记蛋白的用量一般是标记蛋白的用量一般是120 g，碘化反应的体积控，碘化反应的体积控制在制在0.1ml之内，反应时间为之内，反应时间为1min左右。左右。 4 蛋白质中含有甲硫氨酸，半胱氨酸对氧化剂敏感

31、蛋白质中含有甲硫氨酸，半胱氨酸对氧化剂敏感 ,要要减少氯胺减少氯胺-T的用量和缩短作用时间的用量和缩短作用时间. 注意事项注意事项 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Iodogen法法 Iodogen商品名为氯甘脲，化学名商品名为氯甘脲，化学名1,3,4,6-四氯四氯3 ,6 -二苯二苯-甘脲，它与氯胺甘脲，它与氯胺-T同属氯酰胺类，也是氧化剂，氧化作

32、用同属氯酰胺类，也是氧化剂，氧化作用中等，不溶于水，可溶于二氯甲烷等有机溶剂中，将其溶中等，不溶于水，可溶于二氯甲烷等有机溶剂中，将其溶液涂布于试管表面，干后形成固相氧化剂，碘化反应就在液涂布于试管表面，干后形成固相氧化剂，碘化反应就在涂有固相氧化剂的试管内进行涂有固相氧化剂的试管内进行. Iodogen用量在用量在10-20 g左右，反应时间长短视不同蛋白左右，反应时间长短视不同蛋白质而定，一般在质而定，一般在15min之间，碘化反应完毕吸出反应混之间，碘化反应完毕吸出反应混合物，反应即终止。合物，反应即终止。 主要优点是对蛋白质损伤小主要优点是对蛋白质损伤小, 它不用还原剂，不存在因还它不

33、用还原剂，不存在因还原剂引起对蛋白质中二硫键的破坏。原剂引起对蛋白质中二硫键的破坏。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 乳过氧化物酶法乳过氧化物酶法 乳过氧化物酶乳过氧化物酶 (LPO) 在本法中用作催化剂，它和过氧化氢在本法中用作催化剂，它和过氧化氢作用，生成新生态氧，使负碘离子氧化成分子碘，最后形成作用，生成新生态氧，使负碘离子氧化成分子碘，最后形

34、成正碘离子，置换蛋白质中酪氨酸残基中酚羟基邻位的氢。正碘离子，置换蛋白质中酪氨酸残基中酚羟基邻位的氢。 在反应中，乳过氧化物酶用量极少，仅为标记配基在反应中，乳过氧化物酶用量极少，仅为标记配基1% 的的量，以减少酶自身碘化而引入放化杂质。量，以减少酶自身碘化而引入放化杂质。 过氧化氢的用量也很少，起始加入过氧化氢的用量也很少，起始加入50-100ng，以后每隔，以后每隔10-15min补加过氧化氢补加过氧化氢 (30ng-50ng) 一次，共一次，共4次左右，最后用次左右，最后用硫基乙醇终止反应。硫基乙醇终止反应。 本法也比较温和，但操作比较麻烦，现在多数已被本法也比较温和，但操作比较麻烦，现

35、在多数已被Iodogen法取代。法取代。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 偶联标记法偶联标记法 又称简接标记法，或又称简接标记法，或Bolton-Hunter法。如果待标记的配基不法。如果待标记的配基不含酪氨酸残基，上述三种方法将有困难，可以考虑采用偶联标含酪氨酸残基，上述三种方法将有困难，可以考虑采用偶联标记法。记法。 以氯胺以氯胺-T法制备碘标记

36、的法制备碘标记的3,5-(4-羟基苯羟基苯)-丙酸丙酸N-羟基琥珀酰亚羟基琥珀酰亚胺酯胺酯 (HPNS)，然后与蛋白质中，然后与蛋白质中的游离氨基缩合，生成含放射的游离氨基缩合，生成含放射性碘的蛋白质或多肽配基性碘的蛋白质或多肽配基. 上面是125I标记的HPNS. 下面是125I标记HPNS脱去羟基琥珀酰亚胺基，连接到多肽链的末端游离氨基，形成氨基末端加125I标记3-(4-羟基苯)-丙酸的标记多肽.125I -HPNSDept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysic

37、s, Peking University School of Basic Medical science 三三 放射性配基的质量鉴定放射性配基的质量鉴定 1. 放射化学纯度放射化学纯度: 放射性配基的放射化学纯度对受体结合率及分析灵敏度放射性配基的放射化学纯度对受体结合率及分析灵敏度均有较大影响。除新鲜制备的产品外，存放一定时间后的均有较大影响。除新鲜制备的产品外，存放一定时间后的标记配基均应重测其放化纯度，以保证分析的准确性。一标记配基均应重测其放化纯度，以保证分析的准确性。一般要求放化纯度应在般要求放化纯度应在95以上。以上。 2. 结合活性的鉴定结合活性的鉴定 : 受体结合分析中，放射性

38、配基和受体的结合活性特别重要。受体结合分析中，放射性配基和受体的结合活性特别重要。目前，测定配基的活性主要是指与受体的结合能力目前，测定配基的活性主要是指与受体的结合能力（bindability）, 即测定其最大结合即测定其最大结合%, 理论上应为理论上应为100%。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 结合活性的测量方法结合活性的测量方法(JC Ker

39、mode 提出提出):以定量标记配基加逐级增加至过量的受体制剂进行反应，以定量标记配基加逐级增加至过量的受体制剂进行反应，测定结合百分率。测定结合百分率。以结合百分率的倒数对受体浓度的倒数作图，获得一条以结合百分率的倒数对受体浓度的倒数作图，获得一条直线。直线。延长直线与纵座标的交点，即可算出该标记配基结合活延长直线与纵座标的交点，即可算出该标记配基结合活性。性。左图左图: 标记配基结合活性测标记配基结合活性测定示意图定示意图. 交点值为交点值为1.14, 结结合活性合活性=1/1.14=88.7%1Dept.of Biophysics, Peking University School of

40、 Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 3. 放射性配基比活度的测定放射性配基比活度的测定 *受体结合分析结果的计算离不开准确的比活度数据。受体结合分析结果的计算离不开准确的比活度数据。*从配基的比活度算出复合物的比活度，然后复合物的放从配基的比活度算出复合物的比活度，然后复合物的放射性活度除以该比活度，算出受体的分子数。射性活度除以该比活度，算出受体的分子数。*测定配基的比活度，关键是准确测定配基的化学量测定配基的比活度，关键是准确测定配基的化学量

41、, 目目前前,商品化的标记配基商品化的标记配基, 放射活度和化学量的定量都很精确放射活度和化学量的定量都很精确,通常不需要在实验室再测定通常不需要在实验室再测定. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 第二节第二节 受体标本的制备受体标本的制备一一 组织切片组织切片第一种方法先体内给放射性配基进行结合反应后取组织切片第一种方法先体内给放射性配基进行结合反应

42、后取组织切片第二种方法先取进行切片再进行结合反应第二种方法先取进行切片再进行结合反应 整体注射放整体注射放射配基射配基在位灌在位灌流固定流固定取出脏器取出脏器常规切片常规切片大体、光镜或电大体、光镜或电镜自显影镜自显影组织切片整体给放射配基的操作流程图组织切片整体给放射配基的操作流程图 新鲜组织新鲜组织冰冻切片冰冻切片离体放射配离体放射配基结合反应基结合反应大 体 或 光大 体 或 光镜自显影镜自显影常 规 超常 规 超薄切片薄切片电镜自电镜自显影显影组织切片离体给放射配基的操作流程图组织切片离体给放射配基的操作流程图 多聚甲醛多聚甲醛 Dept.of Biophysics, Peking U

43、niversity School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 二二 完整活细胞完整活细胞 *用细胞悬液进行反应用细胞悬液进行反应制备细制备细胞悬液胞悬液试管内进行放射试管内进行放射配基结合反应配基结合反应收集细胞收集细胞测量放射性测量放射性直接向贴壁细胞加放射直接向贴壁细胞加放射配基进行结合反应配基进行结合反应 收集细胞收集细胞测量放射性测量放射性需要注意的问题需要注意的问题*每个培养瓶或培养孔的细胞数应相同每个培养瓶或培养孔的细胞数

44、应相同 *少数培养瓶或培养孔可不加放射配基供细胞定量用少数培养瓶或培养孔可不加放射配基供细胞定量用,蛋白定量蛋白定量,细胞记数细胞记数. *细胞收集方法细胞收集方法,酶消化酶消化,细胞收集器等细胞收集器等 *要有一定数量的培养瓶做非特异结合要有一定数量的培养瓶做非特异结合 *用贴壁细胞进行反应用贴壁细胞进行反应需要注意的问题需要注意的问题: 结果以每结果以每105或或106细胞的受体数表示细胞的受体数表示, 注意保证受体完好无损注意保证受体完好无损 抽滤法抽滤法Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical scien

45、ce Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 三三 亚细胞组分的差速离心法分离亚细胞组分的差速离心法分离 细胞的质膜细胞的质膜,胞浆胞浆,胞核有很多蛋白受体胞核有很多蛋白受体, 打碎成匀浆后，不同打碎成匀浆后，不同的受体就有不同的密度，在一定的介质中它们的沉降速度不同，的受体就有不同的密度，在一定的介质中它们的沉降速度不同，用差速离心法可以将它们分离用差速离心法可以将它们分离. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medic

46、al science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 亚细胞组分制备中的要注意的几个具体问题亚细胞组分制备中的要注意的几个具体问题 1 去除内源性配基及蛋白水解酶去除内源性配基及蛋白水解酶 要用含蛋白水解酶抑制剂的离心缓冲液介质溶解标本要用含蛋白水解酶抑制剂的离心缓冲液介质溶解标本, 反复离心反复离心 (40000g, 1530min)，3次以上次以上, 弃上清弃上清, 收集沉淀即可收集沉淀即可. 名称应用浓度名称应用浓度EDTAEGTA苯甲基磺酰氟 (PMSF)抑蛋白酶肽(Aproti

47、nin)110mmol/L110mmol/L100ug/ml1-2g/ml亮抑蛋白酶肽 Leupeptin胃蛋白酶抑制剂 Pepstatin ATLCK tosyllysine chloromethyl ketoneTPCK tosylphenylalanine chloromethyl ketone1-2g/ml1-2g/ml50g/ml100g/ml常用于受体放射配基测定介质中的蛋白水解酶抑制剂常用于受体放射配基测定介质中的蛋白水解酶抑制剂 2 受体标本的保存受体标本的保存 一般标本的匀浆一般标本的匀浆(除结合反应外除结合反应外)都在都在0-4下操作下操作, -70保存保存, 一般能保存半

48、年一般能保存半年. 这种方法最常用于膜制剂，所以也称为洗膜法。这种方法最常用于膜制剂，所以也称为洗膜法。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 3 受体蛋白从膜结构或核中溶脱成为可溶性受体蛋白受体蛋白从膜结构或核中溶脱成为可溶性受体蛋白 一般来说核受体主要用高浓度一般来说核受体主要用高浓度KCl，膜受体主要用表面活性，膜受体主要用表面活性剂剂(去垢剂去垢剂

49、) 溶解溶解, 通过离心和冷冻浓缩通过离心和冷冻浓缩, 获得纯度教高的蛋白获得纯度教高的蛋白.受体类别主要溶脱试剂(均用缓冲液配制)基本溶脱条件（不同受体可能有一定差异）核受体酪氨酸激酶受体离子通道受体G-蛋白偶联受体0.4 mol/L KCl1% (V/V) Triton X-1001% CHAPS1.5% 毛地黄皂甙04, 振摇1小时室温振摇半小时或04振摇1小时04，振摇0.51小时04，振摇0.51小时几种溶脱剂的使用方法几种溶脱剂的使用方法4 受体蛋白的进一步纯化受体蛋白的进一步纯化 常用的亲合层析常用的亲合层析,离子交换层析离子交换层析, 高效液相色谱等技术高效液相色谱等技术 主要

50、用来分析受体的结构、结构和功能的关系主要用来分析受体的结构、结构和功能的关系 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 第三节第三节 放射配基结合反应放射配基结合反应针对不同的实验目的，放射配基结合反应有多种类型针对不同的实验目的，放射配基结合反应有多种类型 单纯求受体密度单纯求受体密度 同时求受体密度和同时求受体密度和亲和力亲和力 可用选择性放射配基做多点饱

51、可用选择性放射配基做多点饱和分析和分析;也可用无选择性的放射也可用无选择性的放射配基和有选择性的非标记配基配基和有选择性的非标记配基作多点竞争结合分析。作多点竞争结合分析。 用单点结合分析用单点结合分析需要用多点饱和分析需要用多点饱和分析求不同亚型的受体求不同亚型的受体密度和亲和力密度和亲和力Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 放射配基结合反应的一些共同

52、问题放射配基结合反应的一些共同问题1 反应介质反应介质 *放射配基结合分析尽量模拟生理条件，以达到高的结合率放射配基结合分析尽量模拟生理条件，以达到高的结合率 .*常见缓冲液有常见缓冲液有:磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、缓冲液、HEPES缓冲液等缓冲液等 , pH7.47.8 *制备受体标本的缓冲液时通常要加一些附加成分制备受体标本的缓冲液时通常要加一些附加成分: 附加成分中的蔗糖附加成分中的蔗糖0.25mol/L对一些结合反应没有影响，对一些结合反应没有影响，制备缓冲液和反应缓冲液合二为一使用。制备缓冲液和反应缓冲液合二为一使用。 儿茶酚胺类的受体容易氧化失活，制备标本

53、和反应时都儿茶酚胺类的受体容易氧化失活，制备标本和反应时都应含还原剂如维生素应含还原剂如维生素C。Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 钠、镁等离子在不同的受体系统中会有不同的影响，钠、镁等离子在不同的受体系统中会有不同的影响，需根据具体目的决定选用与否。需根据具体目的决定选用与否。 易被蛋白水解酶破坏的受体系统制备标本时需加蛋白易被蛋白水解酶破坏的受体系

54、统制备标本时需加蛋白酶抑制剂，反应缓冲液也应含蛋白酶抑制剂，但需注意有酶抑制剂，反应缓冲液也应含蛋白酶抑制剂，但需注意有些蛋白酶抑制剂有抑制某些受体系统特异性结合的作用，些蛋白酶抑制剂有抑制某些受体系统特异性结合的作用，应当设法避免。应当设法避免。 受体蛋白的反应终浓度最好在受体蛋白的反应终浓度最好在0.1mg/ml以上，蛋白量以上，蛋白量过少可能因管壁的吸附作用而影响结果的准确性过少可能因管壁的吸附作用而影响结果的准确性. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophys

55、ics, Peking University School of Basic Medical science 2 标记配基浓度标记配基浓度标记配基浓度的选择标记配基浓度的选择, 一般来说，应当兼顾两个方面一般来说，应当兼顾两个方面: 一是在同一实验中放射性最低的一点应能满足测量统一是在同一实验中放射性最低的一点应能满足测量统计学的要求计学的要求. 二是放射配基的用量应尽可能低，使非特异结合不致太二是放射配基的用量应尽可能低，使非特异结合不致太高，而且整个实验的费用控制在能承受的范围内高，而且整个实验的费用控制在能承受的范围内. 标记配基浓度一般选择在标记配基浓度一般选择在0.110倍倍Kd间间

56、. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 3 测量非特异结合的非标记配基浓度测量非特异结合的非标记配基浓度 特异结合特异结合=总结合总结合-非特异结合非特异结合 非特异结合通常都用平行管测定，该管反应体积、孵非特异结合通常都用平行管测定，该管反应体积、孵育条件、分离条件、受体浓度、放射配基浓度都和总结育条件、分离条件、受体浓度、放射配基浓度都和总结合管完全

57、相同合管完全相同. 非特异结合管含有较大量的非标记配基，结果特异结非特异结合管含有较大量的非标记配基，结果特异结合完全被抑制，于是测得的放射性就代表非特异结合。合完全被抑制，于是测得的放射性就代表非特异结合。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 测量非特异结合的非标记配基浓度方法测量非特异结合的非标记配基浓度方法: 向反应系统中逐步增加测定非特异结合的非

58、放射性配基浓度向反应系统中逐步增加测定非特异结合的非放射性配基浓度, 可以得到如图所示的曲线可以得到如图所示的曲线. 图中低浓度时只有部分特意结合被抑制，随浓度增加而抑制图中低浓度时只有部分特意结合被抑制，随浓度增加而抑制逐步显著逐步显著 (图中图中A段段). 到达一定浓度时为一个平段到达一定浓度时为一个平段.该平段表示特该平段表示特异结合已完全被抑制异结合已完全被抑制(图中图中B段段). 如果继续加大非放射性配基浓如果继续加大非放射性配基浓度，则非特异结合也将被抑制度，则非特异结合也将被抑制, 平段又开始下降平段又开始下降 (图中图中C段段)。 用于非特异结合测定的非标记用于非特异结合测定的

59、非标记配基浓度的合理选择应是平段的配基浓度的合理选择应是平段的浓度浓度, 应当选择应当选择B区区. 通常非放射性配基的浓度是通常非放射性配基的浓度是放射形配基浓度的放射形配基浓度的1000倍倍Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 非特异结合是高容量、低亲和力结合，不易饱和，如各非特异结合是高容量、低亲和力结合，不易饱和，如各管所加管所加LT不同，则非特异结

60、合通常和不同，则非特异结合通常和LT的量呈线性关系，的量呈线性关系，在普通坐标上呈一逐步上升的直线。据此，实际工作中不在普通坐标上呈一逐步上升的直线。据此，实际工作中不需要每一不同剂量的需要每一不同剂量的LT都做平行的非特异结合管，只需都做平行的非特异结合管，只需总共做总共做3点，通过直线回归即可求出任何点，通过直线回归即可求出任何LT时的非特时的非特异结合。异结合。非特异结合特点非特异结合特点:Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking Uni