姜油酮在太平洋白对虾幼体(南美白对虾)的膳食管理上有促增长、增强非特异性免疫应答和抵抗溶藻弧菌的作用

1、姜油酮在太平洋白对虾幼体（南美白对虾）的膳食管理上有促增长、增强非特异性免疫应答和抵抗溶藻弧菌的作用摘要11.引言12材料和方法42.1饲料的准备42.2虾的饲养52.3 虾的增长和存活情况52.4 虾对溶藻弧菌的敏感性62.5非特异性免疫应到实验62.5.1总血细胞的测定72.5.2 酚氧化酶（PO）活性的测定72.5.3呼吸爆发的测定72.5.4 超氧化物歧化酶SOD的测定82.5.5 吞噬活性的测定82.5.6溶菌酶活性的测定92.6 统计分析93 结果103.1 虾生长和存活的情况103.2 面对溶藻弧菌时含姜油酮的饲料对南美白对虾的存活所起的作用103.3喂了含姜油酮饲料虾的免疫参数

2、114 讨论16参考文献：18摘要姜油酮是姜的一种活性成分，它是一种酚醛树脂烷酮有着抗氧化和抗炎症的特性。主要研究了姜油酮在太平洋白对虾幼体的生长、免疫和抵抗疾病上的作用。四种实验饮食，包括一个空白对照（没有姜油酮）和分别使用了含有1、2.5、5mg姜油酮。56天的培养之后，喂了补充1、2.5、5mg姜油酮饮食的虾与空白对照相比在体重和饲料转化率上有明显的增加。而且，培养了56天，通过24-72小时的病菌和溶藻弧菌的挑战之后得知，喂了所有剂量姜油酮食物的虾与空白对照比有更高的存活率。重要的是喂了所有剂量的姜油酮的饲料的虾酚氧化酶水平明显增加，并且喂了2.5、5mg姜油酮虾的呼吸爆发、溶菌酶和吞

3、噬活性也有显著增加。并且不同的剂量和空白对照，不管是总的血细胞数还是超氧化物歧化酶的活性都有明显的增加。结果表明姜油酮可以被认为是使虾饲料的补充物，从而使虾的生长、免疫、和抵抗病原体和溶藻弧菌的抗病性增加。使用姜油酮作为开胃物和免疫刺激剂是有希望的。1.引言 水产养殖业的饲料产品经常消耗大部分的野生渔业产品。既然许多来自植物的混合物有许多活性被人们所熟知，比如抗应激、促生长、开胃、滋补、免疫刺激剂和抗菌的特性，决定了怎样从植物中来发展经济健康的饲料产品已经成为水产业感兴趣的话题。因此，为了预防和控制虾疾病，与病理学、生理学和遗传学相比，对营养、环境和生态毒理学的研究对于探索虾免疫力的了解同样很

4、重要。 姜，最长时间被人们使用的一种草本植物，已经广泛的用于传统的中国、印度和日本的医药方面已超过25世纪。之前的研究表明姜在抗氧化、抗炎症、降血脂、抗癌、防晕、抗血栓形成、心血管疾病和抗菌过程中扮演多种角色。许多研究也表明姜对于许多水生动物的生长和免疫系统是有利的。比如，姜的使用可以使斑节对虾幼体后期有显著的体重的增加和特定的生长速率，并且增加了罗非鱼抵抗病原体的能力。 姜的主要成分有姜油酮、姜酮酚、姜酚和姜烯酚。其中一个由Z. officinale分离出的活性成分是姜油酮，一种酚醛树脂烷酮包括一个辣椒素结构（3-甲基-4-羟基苯），它是使姜有辛辣味道的主要有机化合物。在早期的研究中表明姜油

5、酮在哺乳动物的几个功能反应中起重要的左右，比如提高抗炎、抗氧化效果、清除辐射诱导产生的自由基，保护辐射诱导产生的细胞毒作用。除此之外，姜油酮在大鼠模型中，可以通过废除过多的胃肠蠕动来有效的治疗胃肠过度蠕动而产生的腹泻。 太平洋白对虾，南美白对虾天然生长在中南美洲的太平洋沿岸，并且在许多国家普遍作为食物被捕捞和养殖。2008年在台湾南美白对虾的水产品达到了10361公吨。作为主要的养殖虾的物种，虾的养殖产业由于感染了病毒和细菌经常遭到了重大的经济损失。因此，提高太平洋白对虾的免疫力和抗病力，对于虾的养殖业的持续发展是非常重要的。 之前的研究表明总血细胞计数、微分血细胞计数、酚氧化酶活性、呼吸爆发

6、、超氧化物歧化酶活性通常作为评估免疫特性的功能参数。甲壳纲的血细胞包括透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞都属于吞噬细胞并且黑色素产物是由酚氧化酶系统产生的。吞噬细胞是抵抗反映的常见细胞，并普遍被认为是清楚微生物和外源颗粒的主要的途径。在病原体进入血淋巴后，宿主细胞的NADPH氧化酶被激活，它将依次降低氧原子，随后产生几种反应氧中介物，如超氧阴离子、羟基、单态氧和过氧化氢。 超氧阴离子的释放被认为是呼吸爆发，并在杀菌剂的活性中起着重要的作用。超氧化物歧化酶也被认为能催化歧化作用快速的两步，通过减少和氧化金属离子的活性位点来使有毒的超氧化物阴离子变成氧分子和过氧化氢。而且，溶菌酶是抗菌多肽家族的一员。

7、它通过水解细菌细胞壁肽聚糖的-1,4糖苷键，并作为天然免疫重要的生物反应器。这些参数已经在南美白对虾上有报道。 这项研究的目的是决定在太平洋白对虾上使用姜油酮是否能够增加生长速率、提高免疫力、和对弧菌的疾病抵抗力。被检测的免疫参数包括总南美白对虾的血细胞数、酚氧化酶活性、呼吸爆发、超氧化物歧化酶活性、吞噬活性和溶菌酶活性，和喂了含姜油酮饲料的虾对溶藻弧菌的敏感性。2材料和方法2.1饲料的准备表1是实验饲料的设计，实验饲料中姜油酮的水平随着总的纤维素含量的下降分别为1，2.5，5mg。材料在锤式粉碎机上研磨直到能通过60网筛，实验饲料是准备好的混合的干的组分加鱼油，再加水直到硬的面团形成。每种饲

8、料都要经过碎肉机，形成意大利细面条式的短的链型，并在干燥箱中35使用鼓风机使湿度达到10%。干燥后的小球放在4的小盒中直到被使用。实验饲料的常规分析表明湿度(6.78%-7.63%)、灰(16.33%-16.76%), 粗蛋白(46.25%-46.73%), 或醚提取物(15.59%-15.87%)水平在实验饲料上没有明显的不同。2.2虾的饲养南美白对虾的幼体由国际屏东科技学校的水产部门提供.到达以后把他们放在玻璃纤维强化塑料箱适应实验室的环境7天，并喂一种商业饲料。实验条件在试验阶段要与实验开始时相似。 总共有五个实验组。480只虾随机分成四个实验组，分别为一组空白对照（喂没有添加姜油酮的饲

9、料），另外三组饲料分别添加了1，2.5，5mg的姜油酮。每组有三个重复，每个重复有四十只虾放在放在1吨的可循环利用的玻璃纤维强化塑料箱内，里面装有0.8吨的水 ，水的盐度是32：其中10只虾用于敏感实验，30只虾作为免疫应答实验。对于敏感实验，另外30只作为空白对照组喂不含姜油酮的饲料，之后再注射20ml的生理盐水。一个单独的通氧石块使溶解氧维持在6 mg L-1。在08：00和17：00时，虾按体重的8%来喂食两次。这个总量接近于虾在适应环境阶段每天最大的消耗量。没有被吃的食物在喂食1小时后收集起来，立即放在80的烘箱烘干。总的实验的食物量等于减去没有被吃的部分，数据每天记录一次。在实验阶段

10、，水的温度维持在28±1，ph在7.8-8.0，盐度是32。2.3 虾的增长和存活情况在56天饲养实验之后，在每一个水族箱中的虾进行批量称重。虾的增长是通过测量在水族箱中存活的的虾的体重增长百分比，计算公式是100×（最后的体重-最初的体重）/最初的体重，饲养率=（最后的体重-最初的体重）/采食量。2.4 虾对溶藻弧菌的敏感性溶藻弧菌是从患病的南美白对虾中分离出来的。一个被用于研究的是已知的南美白对虾的病原种系，它是从台湾屏东被感染的南美白对虾中分离得到。在胰胨大豆琼脂斜面在28培养24个小时，在转接到胰化蛋白大豆液体培养基在28培养24个小时。液体培养基在47155g离心

11、20分钟。倒掉上清液，沉淀用0.85%的盐溶液重悬沉淀，107CFUml-1用于敏感实验。 56天的饲养实验最后时期，从5个实验组中数150只虾进行称重，每组选30只。2.5非特异性免疫应到实验 这里有4个实验组，每一组包括三个重复。对于每个重复，每个实验组有30只虾，随即取样来评估免疫参数包括：总的血细胞数、酚氧化酶活性、呼吸爆发、超氧化物歧化酶活性、吞噬活性和溶菌酶活性。最后总的称重之后，把每只虾的污渍弄干，并用一个带有25标准尺寸针头的1ml的注射器从每只虾的腹血窦抽取血淋巴，针头要用抗凝剂（包括30mM的柠檬酸三钠、0.34mM氯化钠、10mM乙二胺四乙酸EDTA、0.12M葡萄糖、p

12、h7.55并用葡萄糖使渗透压调到780mOsmkg-1）润洗。血淋巴放在实验管中，并立即用等体积的抗凝剂来稀释防止凝结并使血淋巴保持完整。2.5.1总血细胞的测定 100ul的血淋巴用900的抗凝剂溶液包括30mM的柠檬酸三钠、0.34mM氯化钠、10mM乙二胺四乙酸EDTA、0.12M葡萄糖、ph7.55并用葡萄糖使渗透压调到780mOsmkg-1）混合。一滴稀释的血淋巴放在血细胞计数器上用倒置相差显微镜(奥林巴斯 IX 71，日本东京)测量THC。2.5.2 酚氧化酶（PO）活性的测定PO活性是用分光光度计来测量由苯丙氨酸形成的多巴色素，这是根据之前的研究过程。虾PO活性的光密度是用50u

13、l的血淋巴形成的多巴色素来表示的。2.5.3呼吸爆发的测定· 血淋巴O2-的活性是根据之前的描述用氮蓝四唑的减少生成甲瓒的方法来进行测量超氧化物阴离子的含量。简言之，100ul含有抗凝剂溶液的血淋巴放在多空板上，之前涂油L型多聚赖氨酸的用以提高细胞的粘着力。这个多空板在700g离心20分钟。血浆被除去后，添加100ul酵母聚糖(0.1%改进的完全汉克平衡盐溶液HBSS：10mM氯化钙、3mM氯化镁、5mM的硫酸镁)并在室温反应30min。丢掉酵母聚糖，血细胞用100ul的改进的完全的HBSS洗三次，并用100ul的NBT溶液（0.3%）在室温下浸染30min。移去NBT溶液并用100

14、%的甲醇混合，再用70%的乙醇洗三次，风干。甲瓒通过添加120ul的2M KOH和140ul二甲亚砜DMSO来溶解.在630nm的光密度用酶标仪来测定。呼吸爆发用50ul血细胞的NTB的减少来表示。2.5.4 超氧化物歧化酶SOD的测定· 细胞超氧化物歧化酶的活性是用一个工具包（英国郎道，克拉姆林，英国）通过抑制超氧游离基的独立反应来测量的。简言之，1.7ml的反应混合物包括0.05mM黄嘌呤和0.025mM的2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑氯溶解在50mM丙磺酸和0.94Mmedta.在250ul有80ul的黄嘌呤氧化酶、超氧化物、和尿酸，它们是由黄嘌呤产生的

15、。超氧游离基然后和INT反应产生红色的甲瓒染料。在505nm，37测OD值。反应速率是加入黄嘌呤氧化酶3min后吸光值为0.5时来进行测定。Ransod kit提供一个SOD的参考标准。特殊的活性是用SOD U（g蛋白）来表达。2.5.5 吞噬活性的测定 吞噬活性是根据之前研究的方法来进行分析的。对于吞噬活性和清除效率的测定，20ul含虾的2×107CFU的细菌悬液注射到腹血窦。注射之后，把虾放在含有40L水的分离池养殖3h。之后2从腹血窦中吸取200ul的血淋巴并与200ul的无菌抗凝剂混合。混合后的样品平均分为两份，其中一份用于测量吞噬活性。 吞噬活性是用Liu和 Chen描述的

16、方法来分析的。吞噬活性被定义为对溶藻弧菌的吞噬速率（PR）如：PR=吞噬血细胞数/总的血细胞数×100%。2.5.6溶菌酶活性的测定溶菌酶活性是根据之前描述的方法来进行测定的。离心500ul的稀释的血细胞，沉淀物混有1ml的（0.02%）溶壁微球菌。这个反应是在室温下进行，并测量为30s和4.5分钟的吸光值。一个溶菌酶活性单位被定义为每分钟使吸光值降低0.01的样品总量。2.6 统计分析 Tukey的多重比较实验是利用SAS电脑软件来比较实验组的显著差异。所有的数据(敏感性的研究)在分析之前要使用反正弦变换使其标准化。要求数据的显著差异p<0.05.3 结果3.1 虾生长和存活

17、的情况在56天的饲养实验之后，分别喂了1，2.5，和5mg的姜油酮的虾体重增加的多，没喂含姜油酮添加物饲料的虾增长最少（p<0.05）(Table 2).在处理的过程中虾的存活率是96.7%93.3%，在研究条件下养殖，虾的生长是标准的。3.2 面对溶藻弧菌时含姜油酮的饲料对南美白对虾的存活所起的作用养殖56天之后，随机选取虾来进行病原菌实验（溶藻弧菌）。所有的空白对照组的虾都存活。在空白对照组，致死率发生在注射溶藻弧菌12h之后。在24-60小时挑战后，喂了含1，2.5，和5mg的姜油酮饲料的下的存活率明显明显高于空白对照组（p <0.05）(Table 3).最后72小时，空白

18、对照组和喂了1，2.5，和5mg的姜油酮/kg饲料的实验组的存活率分别是50%, 56.7%, 83.3%, 和86.7%。而且喂了2.5，和5mg的姜油酮/kg饲料的虾的存活率比喂了1mg姜油酮/kg饲料的实验组和空白对照组的存活率高。3.3喂了含姜油酮饲料虾的免疫参数 图1中展示了喂了含姜油酮饲料和空白对照后，养殖56天虾的血细胞总数THCs和酚氧化酶活性PO。根据记录虾的总血细胞数没有显著差异，空白对照组和喂了1，2.5，和5mg的姜油酮/kg饲料的实验组的总血细胞分别为(11.4 ±1.52)× 108,(12.1±1.01) ×108, (13

19、.5 ±1.03) ×108, 和 (14.2±1.53) ×108细胞ml_1。（表1A）虾在所有含姜油酮的实验组与空白对照相比更高的酚氧化酶活性。空白对照组和喂了1，2.5，和5mg的姜油酮/kg饲料的实验组的酚氧化酶活性分别为0.15±0.02, 0.32±0.01, 0.35±0.03,和 0.36±0.03。（表1B） 喂了2.5，和5mg的姜油酮/kg饲料的虾与空白对照和喂了1mg的姜油酮/kg饲料的实验组相比有更高的呼吸爆发。空白对照组和喂了1，2.5，和5mg的姜油酮/kg饲料的实验组的呼吸爆发分别

20、为0.12±0.02, 0.13±0.01, 0.16±0.03,和 0.17±0.01。(图 2A).培养56天后，对照组和实验组的超氧化物歧化酶没有显著差异。对照组和实验组SOD的活性的范围是1.56-1.71U/g蛋白。 (图 2B).含姜油酮的饲料对溶藻弧菌的噬菌作用和溶菌酶活性的效应在表3中表示。喂了2.5，和5mg的姜油酮/kg饲料的虾与空白对照和喂了1mg的姜油酮/kg饲料的实验组（p <0.05）相比噬菌作用和溶菌酶活性有显著的增加。空白对照和喂了1，2.5，和5mg的姜油酮/kg饲料的虾吞噬活性分别是10.5%±1.13

21、%, 11.3%±0.95%,14.2% ± 1.52%, 和 14.6%±1.27%,(图 3A). 空白对照和喂了1，2.5，和5mg的姜油酮/kg饲料的虾溶菌酶活性分别是2.02± 0.23 Units mL_1, 2.15± 0.18 Units mL_1, 2.74± 0.22 Units mL_1 and 2.96±0.23 Units mL_1, ,(图 2B).4 讨论姜是一种很强的抗氧化物质，并被认为是一种只有很少不明显副作用的安全的草本药物。尽管已经有很多研究表明姜有利于动物的增长，但很少研究调查它对虾的

22、免疫应答和疾病的抵抗。除此之外，之前在姜上的研究主要在它的提取物上，很少研究它成分的作用。现在的研究表明姜油酮是一种药用的活性成分，对提高太平洋白对虾的生长率和对溶藻弧菌的疾病抵抗力上有显著的成效。· 为了发展可选择的方法来提高水产养殖业增长率，使用姜的提取物来提高硬骨鱼和虾生长。比如，喂了姜的虹鳟鱼在生长、饲料转化率、蛋白效率上有明显的增长。在饲料里添加姜的丙酮提取物来提高罗非鱼的增长已经被报道。在甲壳类，给一角鲸属的后期幼体喂姜强化卤虫后在体重和单位生长速率有显著的提高。姜比例的增加相应的提高饲料的转化率。而且随着姜含量的增加消化酶活性也有显著的提高。目前的研究是从姜里分离出来一种组分并进一步分析它在太平洋白对虾上的作用。喂了1，2.5，和5mg的姜油酮/kg饲料的虾都表明在体重和FE与空白组相比都有明显的增加。从表2得知，5mg的姜油酮/kg提高生长66%的结果是非有前景的。这些结果表示与之前研究的喂含姜提取物饲料的虾相比，喂姜油酮的虾长的更好。这表明姜里面的姜油酮在虾的生长和FE上起着积极的作用。 对于虾的养殖产业决定怎样提高疾病的抵抗力是非常重要的。药草提取物在面对病原体的挑战时可降低鱼和虾的致死率。既然免疫增强剂可以通过提高细胞的吞噬作用、杀