肠功能恢复汤对肠缺血-再灌注损伤大鼠肠黏膜屏障的影响

1、肠功能恢复汤对肠缺血-再灌注损伤大鼠肠黏膜屏障的影响         11-01-09 15:53:00     作者：王春荣，程永刚，祁翔    编辑：studa20【摘要】  目的 观察肠功能恢复汤对肠缺血-再灌注损伤大鼠肠黏膜屏障的影响，探索多器官功能障碍综合征的新的防治途径。方法 SD大鼠45只，随机分为3组：正常对照组、肠缺血-再灌注损伤模型组、肠功能恢复汤治疗组，分别检测各组血清中二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸含量

2、，收集小肠灌洗液并测定灌洗液中的溶菌酶含量，同时取肠系膜静脉血、肠系膜淋巴结、肝及脾组织进行细菌培养，观察细菌移位情况，取回肠组织制成石蜡切片，HE染色光镜下观察，测量小肠黏膜厚度、绒毛高度和隐窝深度，取回肠组织制成电镜标本，透射电镜观察。结果 肠功能恢复汤组与模型组相比，血清中DAO和D-乳酸含量均显著降低(P<0.01)，小肠灌洗液中溶菌酶含量显著升高(P<0.01)，细菌移位率显著降低(P<0.01)。肠功能恢复汤组小肠黏膜的病理形态明显好于模型组。结论 肠功能恢复汤对肠缺血-再灌注损伤大鼠的肠黏膜屏障具有保护作用。 【关键词】  肠功能恢复汤 肠缺血-再灌注

3、损伤 肠黏膜屏障ABSTRACT: Objective  To investigate the effect of the decoction to help recover intestinal function on the intestinal mucosal barrier of rats with gut ischemia-reperfusion injury. Methods  Forty-five SD rats were divided into three groups randomly: control group, gut ischemia-reper

4、fusion injury group and decoction group. We detected the content of DAO and D-lactate in serum and lysozyme in perfusate of intestine in each group. We observed the bacteria translocation, the change of ileum mucous membrane in pathomorphology and intestinal villi. Results  Compared with those

5、in gut ischemia-reperfusion injury group, the contents of DAO and D-lactate and bacteria translocation ratio were all lower in decoction group (P<0.01), but the content of lysozyme in perfusate was higher (P<0.01). The ileum mucous membranes in decoction group were better than in gut ischemia-

6、reperfusion injury group in pathomorphology. Conclusion  The decoction to help recover intestinal function can protect the intestinal mucosal barrier of rats with gut ischemia-reperfusion injury from damage.KEY WORDS: decoction to help recover intestinal function; gut ischemia-reperfusion injur

7、y; intestinal mucosal barrier大量研究显示肠道活跃参与创伤、烧伤和感染后的各种应激反应，是多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)发生的始动器官1-2。肠缺血-再灌注损伤是肠黏膜屏障破坏的基本因素之一。肠功能恢复汤由大黄、丹参等10余味中药组成，具有促进肠蠕动，促进术后肠功能恢复及肠道营养吸收等作用，其对肠道黏膜屏障是否具有保护作用，目前尚未见相关报道。本实验通过观察肠功能恢复汤对肠缺血-再灌注损伤大鼠肠黏膜屏障的影响，探索MODS新的防治途径。1  材料与方法1.1  材料

8、60;SD大鼠45只，SPF级，雌雄不限，体重(248.3±16.3)g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。T6型新世纪紫外光分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；超速离心机(北京医用离心机厂)；RM2025型组织切片机(德国LEICA公司)；Olympus光学显微镜(日本)；H-600型透射电镜(日本日立公司)；VIDAS-21型自动图像分析仪(德国OPTON)；DAO标准品、邻联二茵香胺购自美国Sigma公司；D-乳酸标准品、D-乳酸脱氢酶购自南京凯基生物发展有限公司；溶菌酶购自中科院生物物理所生化厂，溶壁微球菌由西安交通大学医学院免疫学与病原生物学系提供。肠功能恢复汤

9、：大黄20 g(后下)、丹参12 g、党参15 g、白术15 g、陈皮15 g、木香12 g、桃仁12 g、赤芍15 g、火麻仁30 g、枳实12 g等组成，由西安交通大学医学院第一附属医院中药制剂科提供，浓缩煎制成浓度为11药液(含生药1 g/mL)，灭菌处理后4 冰箱内保存。1.2  肠缺血-再灌注损伤动物模型3的建立 大鼠于造模前24 h禁食，自由饮水。称重后给予腹腔注射100 mL/L水合氯醛(30 mg/100 g)麻醉，实验台上仰卧固定，腹部脱毛后常规消毒铺无菌巾，取腹部正中切口进腹，暴露肠系膜上动脉(superior mesenteric artery, SM

10、A)，各组分别用无创夹夹闭其根部45 min，松夹即为再灌注。1.3  动物分组 45只大鼠随机分为3组，正常对照组(control group)15只：正常大鼠生理盐水灌胃；肠缺血-再灌注损伤模型组(I/R group)15只：造模后 ，生理盐水灌胃；肠功能恢复汤治疗组(decoction group)15只：造模后即给予肠功能恢复汤灌胃；均为1 mL/100 g，2次/日，连续2日。1.4  血清二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸含量的测定各组动物于造模成功48 h后，用100 mL/L水合氯醛(30 mg/100 g)麻醉，严格无菌操作下采取门静脉血，采用黎君友

11、等4的分光光度法测定血清DAO活性；采用Brandt等5的分光光度法测定血清D-乳酸含量，均严格按说明书操作。1.5  小肠灌洗液中溶菌酶含量的测定 麻醉后立即剖腹切取从屈氏韧带到距回盲部5 cm处的肠管，用生理盐水洗去浆膜上的污物，然后以100 mL/L乙酸50 mL灌洗小肠，将小肠灌洗液在4 ，5 000 r/min，离心30 min，收集上清液装入透析袋，透析18 h除去乙酸以及其他小分子物质，然后冷冻干燥，得到小肠灌洗液乙酸溶解物，用琼脂平板扩散法测其溶菌酶的含量。1.6  细菌培养 麻醉后，无菌条件下打开腹腔，分别取肠系膜淋巴结(mesente

12、ric lymph node, MLN)、肝及脾组织各0.5 g，加入生理盐水1 mL制成匀浆，取匀浆液0.5 mL，接种于直径10 cm中国兰培养基平皿内，同时取肠系膜上静脉血0.5 mL加入血培养基中作细菌培养，37 条件下孵育48 h，如果培养基平皿菌落数多于100个/g组织记为细菌培养阳性，细菌移位率按细菌培养的阳性脏器数/培养脏器总数计算。1.7  小肠黏膜病理形态学观察和小肠绒毛高度的测量 麻醉后于距盲肠5 cm处取回肠组织，100 mL/L甲醛固定，石蜡包埋切片，行HE染色，光镜观察。每只动物选取一张石蜡切片，在病理图像分析仪上进行黏膜厚度、绒毛高度、隐窝深度

13、的测量。于距盲肠5 cm处取回肠组织约0.5 cm，用生理盐水冲洗管腔，将肠管纵向剪开，浆膜面向下铺于无水滤纸上，将组织切成1 mm×3 mm之组织块，置于3 mL/L戊二醛溶液中固定24 h，10 g/L四氧化锇固定，梯度乙醇及丙酮脱水，Epon802树脂包埋，超薄切片包埋、切片，醋酸铀，枸橼酸铅染色，透射电镜观察。1.8  统计学处理 试验数据以均数±标准差( ±s)表示，采用SPSS13.0统计软件进行分析，两组间进行均数差别比较的t检验，细菌移位率采用Fisher确切概率法进行检验，以P<0.05为差异有统计学意义。2  结果2.1  各组