细胞工程育种

1、第十三章细胞工程育种第一节细胞工程的概念与原理第一节细胞工程的概念与原理第二节细胞工程技术第二节细胞工程技术生物技术生物技术 又称生物工程又称生物工程 是以生命科学为基础，利用生是以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计、构建具有预物体的特性和功能，设计、构建具有预期性状的新物种、新品种、新品系，以期性状的新物种、新品种、新品系，以及与工程原理相结合，进行加工生产，及与工程原理相结合，进行加工生产，为社会提供商品和服务的综合技术体系。为社会提供商品和服务的综合技术体系。 通常所说的细胞工程、基因工程、酶工程、发酵工程、生化工程和蛋白质工程等均属此范畴。 预测在2025年到2030年期间，

2、生物技术将取代信息技术成为世界经济社会发展的引擎与火车头。 本章简要介绍细胞和组织培养在植物育种的应用。 细胞工程是现代生物技术的基本技术 第一节细胞工程的概念和原理第一节细胞工程的概念和原理 一、细胞工程的概念一、细胞工程的概念 以细胞为基本单位，按照人们的需要和设计，以细胞为基本单位，按照人们的需要和设计，在离体条件下进行培养、繁殖，使细胞的某些生在离体条件下进行培养、繁殖，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发展或改变，从而改良品物学特性按人们的意愿发展或改变，从而改良品种或创造新种、加速繁育生物个体，获得有用材种或创造新种、加速繁育生物个体，获得有用材料的过程。料的过程。 细胞工程的主要

3、包括细胞工程的主要包括 花药培养、体细胞变异筛选、幼胚培养、原生质体融合、花药培养、体细胞变异筛选、幼胚培养、原生质体融合、试管受精等。试管受精等。二、细胞工程在植物育种上的意义二、细胞工程在植物育种上的意义 1、种质资源保护、种质资源保护 2、优良品种快速繁殖、优良品种快速繁殖 3、诱发和离体筛选突变、诱发和离体筛选突变 4、克服远缘杂交困难、克服远缘杂交困难 5、克服种子发育中的障碍、克服种子发育中的障碍 6、单倍体育种的技术环节、单倍体育种的技术环节 7、生产次生代谢产物（发酵工程、酶工程）、生产次生代谢产物（发酵工程、酶工程） 8、基因工程的基础技术、基因工程的基础技术 三、细胞工程的

4、基本原理三、细胞工程的基本原理 植物细胞全能性是细胞和组织培养的理论基础。植物细胞全能性是细胞和组织培养的理论基础。 细胞是生物体结构和生命活动的基本单位，是细胞是生物体结构和生命活动的基本单位，是细胞工程操作的主要对象。细胞工程操作的主要对象。 细胞核内有保持物种遗传性所需要的全套遗传细胞核内有保持物种遗传性所需要的全套遗传物质所以高度分化的体细胞具有发育成一个生物物质所以高度分化的体细胞具有发育成一个生物体的能力。体的能力。 植物离体的体细胞或性细胞，在离体培养条件植物离体的体细胞或性细胞，在离体培养条件下能被诱导发生器官分化和再生植株，而且再生下能被诱导发生器官分化和再生植株，而且再生植

5、株具有一套与母体植株基本相同的遗传信息。植株具有一套与母体植株基本相同的遗传信息。同样，如果已经突变的细胞组织，其再生植株则同样，如果已经突变的细胞组织，其再生植株则具有与已变细胞组织相同的遗传信息。具有与已变细胞组织相同的遗传信息。第二节细胞工程技术第二节细胞工程技术一、体细胞变异与突变体的筛选（一）体细胞变异及其机制 植物组织细胞培养中DNA复制和细胞分裂增生染色体行为脱离常规是导致细胞及其再生株特征、特性变异的根本原因。第二节 细胞工程技术一、植物组织培养 植物组织培养就是在无菌条件下利用人工培养基对植物组织、器官及原生质体等进行培养。1、选择培养基 不同物种，外植体有差异，组织培养基多

6、种多样。但它们都包含三大类组分：无机成分、有机成分、生物调节物质。不同培养基区别主要是无机盐的含量与种类，变化幅度最大的是生长调节物质，使用时根据培养物的差异，精心选择。无机盐和水大量元素 C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.Cl微量元素 Fe.Cu.Mo.Zn.Mn.Co.B.Na 水蒸馏水、双蒸水或使用去离子水有机化合物 糖碳源和能源氨基酸类 有机氮源维生素类 维生素b1(盐酸硫胺素)、维生素b6(盐酸砒哆醇)、生物素、烟酸、叶酸等生长调节物质 生长素IAA、NAA、2,4-D、IBA细胞分裂素天然： 6-BA、KT（激动素，糠基酰嘌呤）人工：ZT（玉米素）、2-iP 赤霉素 GA成份

7、不定物质 椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥琼脂 从海藻中提取的一种高分子碳水化合物培养基的成分MS培养基适用范围较广米勒培养基（Miller）适用于大豆愈伤组织培养和花药培养尼许培养基（Nitsch)适用于花药培养改良White培养基（怀特）适用于壮苗培养N6培养基适用于单子叶植物花药培养B5培养基适用于豆科、十字花科植物培养基的配制(1)水和药品 水必须采用蒸馏水或无离子水，药品最好采用分析纯，至少是化学纯药品。(2)母液的配置 为方便培养基的制备，现将培养基的各种成份分类配成浓缩的母液，正式配制时按规定用量稀释混合。(3)制备培养基 混合各成分母液 熔化琼脂(4)培养基的消毒 主要有高温高

8、压灭菌和过滤灭菌两种方法。搅拌混匀调pH值分装灭菌放置备用2、选择外植体外植体是用来诱发产生无性增殖系的植物器官或组织切段，如芽、节茎等。选择综合考虑以下因素：大小适宜 组织块达到5-10mg（2万个细胞以上），才容易成活。适宜部位 同一外植体，不同部位其分化能力、分化条件及分化类型都有相当大的差异。新组织 胚和幼龄器官比老器官、老组织更容易脱分化，产生大量愈伤组织。不同物种相同部位的外植体，其细胞分化能力大不一样。总之，外植体的选择要以幼嫩的器官或组织为宜。3、对外植体进行消毒处理 一般程序 外植体 自来水多次漂洗 消毒剂处理 无菌水反复冲洗 无菌滤纸吸干 注意： 消毒剂种类 不同外植体对试

9、剂的敏感程度不同 消毒试剂 幼嫩组织比老组织时间要短些在超净工作台上进行。消毒剂 使用浓度（%） 消除难易 消毒时间（min） 消毒效果次氯酸钠 2 易 530 很好次氯酸钙 910 易 530 很好过氧化氢 1012 最易 515 好溴水 12 易 210 很好硝酸银 1 较难 530 好氯化汞 0.11 较难 210 最好抗生素 450mg/L 中 3060 较好无菌操作、无菌培养4、诱导脱分化 外植体是已分化成各种器官的植物组织。组织培养首先就是让这些组织细胞脱分化，使细胞重新处于有丝分裂的分生状态，诱导愈伤组织。因此，培养基中一般都添加较高浓度的生长素类激素。具体做法是：外植体消毒后，

10、切成小短插入或平放在培养基上即可。二、细胞变异体和突变体选择（一）体细胞变异的机制：1、细胞内DNA重复复制2、三极或多极纺锤体的形成与非整倍体产生3、染色体断裂与重组4、类减数分裂现象（二）体细胞突变体的筛选与利用1、植物细胞突变体的类型、植物细胞突变体的类型（1）抗性突变体 A、抗病突变体 B、抗除草剂突变体 C、抗抗生素突变体 D、抗氨基酸及类似物突变体 E、抗盐突变体 F、抗旱突变体（2）雄性不育系突变体（3）营养缺陷型突变体 缺少某一种物质合成的酶，而不能在基本培养基上生长。（4）各种形态特征和生物学特性突变体 如马铃薯早熟、高产变异，小麦、水稻株型、穗型变异等。2、植物体细胞突变体

11、的诱发和筛选技术（1）材料的选择 A、较易再生植株 B、染色体数目稳定 C、生长速度相对较快 （2）突变诱发）突变诱发在植物细胞培养中自然突变的频率为10-5 10-8，使用诱变剂可使诱变频率提高到10-3 。 A、物理诱变剂。紫外线及各种射线， 可省去洗涤诱变剂的步骤。 B、化学诱变剂。处理后必须将诱变剂洗涤去除。（3）突变体的选择 A、正选择法 也称直接选择，原理是把大量的细胞置于有选择剂培养基上，使正常细胞不能生长，而各种抗选择条件的突变体细胞能生长。如抗盐、除草剂突变体。 B、负选择法 也称富集法，采用某一非允许条件培养基，使突变的细胞不能生长，而野生型能生长，然后加入负选择剂，杀死生

12、长的细胞，不能生长的细胞保留下来。（4）突变体的鉴定 诱变的细胞从选择培养基上转到非选择培养基上后快速生长，然后转到分化培养基上再生植株，可在再生植株上检查突变体的表达，也可在后代的组织培养物上检测。三、花药花粉培养 花药培养指将一定发育时期的花药接种到人工培养基上，再给于特殊的培养条件而产生植株的过程。分化来源于花药中未成熟的花粉，常称为花粉植株，把花药培养与花粉培养相提并论。但是花粉培养和花药培养不完全相同，花药是植物体上的器官，属器官培养，花粉是单细胞，属细胞培养。 培养步骤：1、取成熟度适中的花蕾或幼穗 单核靠边期2、花药消毒3、无菌接种 取出花药，平放在培养基上4、花药培养 诱导阶段

13、、分化阶段5、培养条件 28下光照（12-18h，5000-10000lx)和22黑暗的周期性交替的条件下进行。四、离体胚的培养四、离体胚的培养植物的胚培养主要有两种培养方式：一种是以幼胚为外植体诱导愈伤组织細胞，通过器官发生或胚胎发生产生再生植株；另一种是使发育完全的胚直接萌发，获得完整的植株。离体胚培养在植物育种中的应用主要包括以下三个方面：（1）克服远缘杂交不育）克服远缘杂交不育（2）促进核果类植物胚的形成）促进核果类植物胚的形成核果类早熟品种与晚熟品种的区别是胚发育不健全、生活力不强，而以早熟品种为母本与晚熟品种杂交，很难得到杂交后代。如果用幼胚离体培养就能得到杂交后代。（3）打破种子

14、的休眠期）打破种子的休眠期许多植物的种子存在明显的休眠期，有些植物的休眠期很长。由于种子结构而存在的休眠可以用常规方法消除，而由于胚乳抑制物质所引起的休眠只能通过胚的离体培养才能获得理想的效果。五、原生质体培养和体细胞杂交原生质体培养 是将植物细胞去壁后，放在无菌条件下，使其进一步生长发育的技术。体细胞杂交 是在离体条件下将同一物种或不同物种的原生质体融合，培养并获得再生植株。原生质体融合克服了植物种属间生殖障碍，为新种质创新提供了一条有效途径。一、原生质体的分离与培养一、原生质体的分离与培养（一）原生质体的分离（一）原生质体的分离1、制备原生质的材料、制备原生质的材料 A、自然条件下生长的植

15、株、自然条件下生长的植株 常用的是叶肉细胞叶肉细胞，因来源方便，供应及时，有明显的叶绿体，便于在融合中识别。 B、无菌幼苗、无菌幼苗 无需消毒，实验结果容易重复。 C、外植体来源的愈伤组织、体细胞胚及悬浮、外植体来源的愈伤组织、体细胞胚及悬浮培养细胞培养细胞 可常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便。2、材料的预处理目的目的是提高原生质体产量和代谢活力；逐步降低植物细胞的水势；增强原生质体对高渗透压的适应；使游离的原生质体更能适应新的培养条件。预处理方法： 预培养法、暗处理法、药物及添加物处理法、萎蔫处理法、更新培养基法等。3、原生质体的分离A、机械分离法B、酶分离法 在酶的作用下分

16、解细胞壁，获得原生质体的方法。目前，一般采用酶分离法。 常用的酶类有纤维素酶、半纤维素酶及果胶酶。4、原生质体的纯化 去除未消化的细胞和细胞团，破碎细胞，维官束组织等。A、过滤离心法 原生质体通过40100m滤膜滤器过滤，滤液低速离心5min，原生质体下沉，吸去上清液，在悬浮于同等渗透压的原生质体液体培养基中。 B、漂浮法 根据原生质体、细胞、细胞碎片的相对密度不同而设计的，关键是蔗糖或山梨醇的浓度与离心速度。 5、原生质体活力测定 一般对原生质体活力的检查，凭形态即可识别。 把形态上完整、含有饱满的细胞质、颜色新鲜的原生质体放入略为降低渗透浓度的溶液或培养基中，即可见到分离时缩小的原生质体又

17、恢复原态，那些正常膨大的都是有活力的原生质体。（二）原生质体培养1、培养基及培养条件培养基 不同植物的原生质体对营养的需求不同，应根据试验来决定。培养基的种类很多，效果较好的有KM培养基、KM8P培养基、VKM培养基等。注意：植物激素、原生质体密度、光照和温度、氮源种类等。2、培养方法可分为固体培养法和液体培养法及派生出一些不同形式的培养方法。3、培养过程培养条件满足要求，原生质体首先形成新细胞壁，继而进行分裂，形成多细胞团。在促进分化的条件下还能分化出芽、茎、根，再生成完整的植株。二、原生质体融合（一）融合的基本方法1、原生质体的选择A、原生质体量多、活力强、遗传上一致；B、双亲至少有一方具

18、有诱导原生质体再生成完整植株的成熟技术；C、应带有可供融合后识别异核体的性状，如颜色、核型等；D、在异核体发育中有能选择杂种的标记形状，如营养突变体或对药物敏感等。原生质体的融合，不是没有亲缘界限的，亲缘关系过远的亲本融合则不利于取得圆满的结果，特别是以育种为目的融合来说尤为不利。总之，选择那些既容易融合，又利于杂种筛选，还能形成稳定的遗传重组体，并能再生成植株的原生质体融合，才能获得有效的结果。2、融合方法A、多聚化合物法 在培养物中加入多聚L鸟氨酸、多聚L赖氨酸、葡萄糖硫酸盐等多聚化合物，以促进原生质体融合的方法。多聚化合物能改变原生质体表面的物理特性，增强原生质体的内吞饱饮作用。B、高P

19、H高Ca2+法 将须融合的原生质体防在高PH高Ca2+条件下融合的方法。 C、聚乙二醇法 目前普遍采用的方法，在培养物中加入聚乙二醇，以促使原生质体融合的方法；D、电融合法 用改变电场的方法诱导原生质体融合的方法。3、融合方式A、对称融合 一般指种内或种间完整原生质体的融合，可产生核与核，胞质与胞质间重组的对称杂种，并可发育成为遗传稳定的异源双二倍体杂种植株。远源种、属间经对称融合产生的杂种细胞在发育过程中，常发生一方亲本的全部或部分染色体以及胞质基因组丢失或排斥的现象，形成不对称杂种。B、非对称融合用物理或化学的方法处理亲本原生质体，使一方细胞核失活或使另一方的细胞质失活，在进行原生质体融合

20、。一般采用x射线、射线或紫外线照射原生质体，使细胞核失活或不能正常分裂，但细胞质正常。融合后代只具有一方亲本的细胞核，形成不对称杂种。非对称融合在育种中有广泛的应用：（1）在一定程度上克服了体细胞不亲和的现象，可以得到用一般方法得不到的杂种。（2）是供体单项转移部分遗传物质到受体中去的一种行之有效的方法，这对于转移由多基因控制的具有重要经济价值的性状如抗病性有很大的意义。（3）可以迅速转移细胞质基因，对于一些由细胞质基因控制的性状的转移具有重要意义。（二）原生质融合体的生长发育1、异核体的壁再生 异核体必须长出新的共同的细胞壁才能进行分裂。2、异核体的核融合 一般情况下，异核体的核融合是在两亲

21、本的核同步分裂的情况下发生的，所以异核体进一步生长有两种可能，一种是双亲细胞核在异核体中迅速实现同步分裂，实现了原生质体的真正融合；另一种是双亲之一的染色体可能出现被排斥、丢失或畸变现象。顺利地实现各种植物尤其是亲缘关系较远的原生质体核的融合，是体细胞杂交研究中存在的主要困难之一。3、融合细胞的增殖融合后的杂种细胞，有的可持续细胞分裂，形成愈伤组织，有的分裂12次，甚至上百次，便停止分裂，衰老死亡。4、愈伤组织的器官分化将生长正常而健壮的愈伤组织转移到分化培养基上，诱导杂种植株。在高等植物体细胞研究中，要把两个种的原生质体融合在一起，是十分容易做到的，但要使它产生可育体细胞杂种植株，却受到一定

22、的限制，原因是1、大多数重要经济作物的原生质体不能再生成植株。2、大多数杂种细胞的染色体不稳定，出现了非整倍体，有性繁殖时不孕。3、种间的不亲和性限制了体细胞的不亲和性。 现已获得的体细胞杂交植株例子并不多，进展也不快。第三节 基因工程在植物育种中的应用 作物转基因育种：作物转基因育种： 根据育种目标，从供体生物中分离目的基根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经因，经DNADNA重组与遗传转化或直接运载进入重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，在经过田间试验与大田选择育成工程体，在经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或

23、种质资源。转基因新品种或种质资源。 1. 打破自然生殖隔离，生物可共享一个基因库 2. 有目的地进行基因重组，克服不良连锁 3. 有效克服环境影响，选择更可靠 4. 加快育种进程，加速繁殖，提高育种效率等。转基因技术一、 转基因作物发展历史转基因作物发展历史 1983年首例抗卡那霉素的转基因烟草问世 1986年首批抗虫和抗除草剂的转基因棉花进入田间试验 1992年第一个抗病毒病转基因烟草在中国进行大田种植，揭开了全球转基因作物商业化的序幕 1994年美国第一个转基因耐贮藏番茄批准上市 1996年全球转基因农作物开始大规模种植1996-2007全球转基因农作物种植面积全球转基因农作物种植面积(单

24、位：百万公顷单位：百万公顷)近十年来，种植面积呈直线增加2006-2007年种植转基因农作物的国家和面积年种植转基因农作物的国家和面积(单位：百万公顷单位：百万公顷) 此外，南非此外，南非、澳大利亚、罗马尼亚、西班牙、墨西哥、菲律宾、澳大利亚、罗马尼亚、西班牙、墨西哥、菲律宾、哥伦比亚、保加利亚、德国、印度尼西亚等也有一定种植面积哥伦比亚、保加利亚、德国、印度尼西亚等也有一定种植面积世界上种植转基因作物比较多的国家第一位第一位第二位第二位第三位第三位第四位第四位第五位第五位第六位第六位全球种植转基因农作物种类和面积全球种植转基因农作物种类和面积(单位：百万公顷单位：百万公顷)转基因棉花转基因棉

25、花主要集中在中主要集中在中国和印度国和印度（中国）转基因玉米转基因玉米主要集中在美主要集中在美国和南非国和南非（南非南非）转基因大豆主要集中在美国、巴西和阿根廷转基因大豆主要集中在美国、巴西和阿根廷阿根廷阿根廷我国转基因作物现状我国转基因作物现状我国转基因作物的研究起步早、基础好：始于上世纪80年代，是国际上农业生物工程应用最早的国家之一。经过了20多年的努力，我国已初步形成了从基础研究、应用研究到产品开发的较为完整的技术体系，转基因作物育种的整体发展水平在发展中国家已处于领先地位，某些项目进入了国际先进行列。自1999年以来，国产抗虫棉的市场份额每年以10%左右的速率递增。目前，国产抗虫棉不

26、仅完全打破了跨国公司的垄断，在国内市场上稳居优势，而且开始向印度出口，参与国际市场竞争。转转BtBt基因抗虫棉对棉铃虫的抗性表现基因抗虫棉对棉铃虫的抗性表现由于日益增长的粮食危机，决策者认识到依靠进口技术或进口粮食解决中国13亿人的吃饭问题存在安全风险，所以中国必须依靠科技（如生物技术等）来提高我国粮食总产。中国有一大批的研究所和数千位致力于作物生物技术的研究人员，有十几种正在进行田间试验的转基因作物，其中3个主要产品为水稻、玉米和小麦，还包括棉花、马铃薯、番茄、大豆等十多种作物。 除了抗虫棉以外，我国科学家在抗病、虫水稻、高植酸酶玉米等研究中都获得了可喜的进展。 二、转基因育种的程序基本过程

27、目的基因或DNA的获取含有目的基因或者DNA的重组质粒的构建受体材料的选择和再生系统的建立转基因方法的确定和外源基因的转化转化体的筛选和鉴定转基因植株的育种利用( (一）目的基因的获取一）目的基因的获取1、根据基因的表达产物蛋白质进行基因克隆首先分离和纯化控制目的性状蛋白质或多肽，并进行氨基酸序列分析；然后根据氨基酸序列推导相应的核苷酸序列，采用化学合成的方式合成该基因，利用着这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。2、从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。( (二）载体系统及其改造改造二）载体系统及其改造改造 载体 用于承载、克隆、转移目的基因（DNA片段）能自我复制的DNA分子。如大肠杆菌质

28、粒、农杆菌质粒等。质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体，而自然存在的能自我复制、易分离和导入的链状DNA分子。天然质粒拷贝数低，选择记号少，需要进行修饰改造，以满足基因克隆的需要，理想的克隆载体质粒具有1、复制起点 2、抗菌素抗性基因 3、若干个限制酶单一识别位点，具有较小的分子量和较高的拷贝数，如PBR322是改造的优秀质粒之一。( (三）重组三）重组DNADNA的制备的制备 用限制性内切酶将载体切开用限制性内切酶将载体切开, ,用连接酶把目的基因用连接酶把目的基因连接到载体上，获得重组体连接到载体上，获得重组体 已分离的目的基因一般都保存在大肠杆菌质粒中，在进行外源基因转移前还必须将外源基因重

29、组到合适的载体上，具体采用哪种载体要根据转基因的方法和目的而定。( (四）植物的遗传转化四）植物的遗传转化 植物遗传转化常用的几种方法：1 1、农杆菌介导的植物遗传转化、农杆菌介导的植物遗传转化 主要应用于双子叶植物主要应用于双子叶植物 2 2、基因枪介导的植物遗传转化、基因枪介导的植物遗传转化 主要应用于单子叶植物主要应用于单子叶植物3 3、花粉管通道法介导的植物遗传转化、花粉管通道法介导的植物遗传转化 可用于单双子叶植物，主要集中在中国可用于单双子叶植物，主要集中在中国农杆菌农杆菌Ti质粒含目的基因的Ti质粒目的基因被转入植物体细胞转基因植株农杆菌转化程序农杆菌转化程序 农杆菌介导法是双子

30、叶植物基因转移的农杆菌介导法是双子叶植物基因转移的常用方法。近几年在单子叶植物上先后取常用方法。近几年在单子叶植物上先后取得了突破，包括水稻、玉米、大麦和小麦得了突破，包括水稻、玉米、大麦和小麦等。目前转化成功的植物已达等。目前转化成功的植物已达120多种多种，其，其中根癌农杆菌成功约有中根癌农杆菌成功约有100种种，发根农杆菌，发根农杆菌成功约有成功约有40种种。研究现状研究现状 利用高速金（钨）微粒穿过植物细胞壁，将附着其上的外源DNA直接带引到植物细胞中，然后通过未知的机制整合到植物基因组中。基因枪介导的植物遗传转化基因枪的工作原理基因枪的工作原理 高压气体冲破压力控制膜高压气体冲破压力

31、控制膜片，携带有包裹片，携带有包裹DNA金属离金属离子的塑料膜片高速向下运动，子的塑料膜片高速向下运动，塑料膜片被稍下位置的金属塑料膜片被稍下位置的金属网阻挡，上面的金属离子继网阻挡，上面的金属离子继续高速向下运动，击中样品续高速向下运动，击中样品室中的靶材料，室中的靶材料， DNA随随金属金属离子进入细胞。离子进入细胞。 在植物柱头上，滴放在植物柱头上，滴放10ul 10ul 质粒质粒DNA(1ug/ulDNA(1ug/ul）。）。该质粒该质粒DNADNA载有欲转化的载有欲转化的目标基因目标基因。 载有目标基因的质粒载有目标基因的质粒DNADNA沿花粉管进入子房后，可与受沿花粉管进入子房后，

32、可与受精的合子结合，从而产生转基因种子。精的合子结合，从而产生转基因种子。 待种子收获后，进一步检查是否为转基因种子。待种子收获后，进一步检查是否为转基因种子。 优点：不需要组织培养、易于操作、成本低优点：不需要组织培养、易于操作、成本低花粉管通道法介导的植物遗传转化花粉管通道法介导的植物遗传转化( (四）转基因植物的鉴定四）转基因植物的鉴定1、表形鉴定2 2、 组织化学染色组织化学染色鉴定鉴定 GUSGUS（- -葡萄糖苷酸酶）葡萄糖苷酸酶）基因（基因（标记基因标记基因） GUSGUS基因能产生一种酶，这种酶在体内与其基因能产生一种酶，这种酶在体内与其它酶作用使组织产生深蓝色。它酶作用使组织

33、产生深蓝色。利用利用GUSGUS基因产生的深蓝色鉴定转基因小麦基因产生的深蓝色鉴定转基因小麦 Transgenic wheat with GUSGUS gene 深蓝色的小麦胚深蓝色的小麦胚Embryo stained with X-gluc 深蓝色的小麦芽深蓝色的小麦芽Shoots stained with X-gluc 荧光染色荧光染色 标记基因为标记基因为 GFPGFP。 GFPGFP基因产生的基因产生的绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白可在荧光显微镜下观察。可在荧光显微镜下观察。3 3、 核酸分子杂交（核酸分子杂交（Southern blot 分析）分析） 以被转化基因为探针，与转化植株以被转化

34、基因为探针，与转化植株DNADNA杂交，检查是否杂交，检查是否有特异有特异DNADNA带。带。 转Rs-afp1基因花生的PCR-Southern blotting 分析1：质粒（正对照）；2：非转基因花生植株（负对照）3-8：转基因花生植株.4. 4. RNA分子杂交（分子杂交（Northern blot 分析）分析） 以被转化基因为探针，与转化植株以被转化基因为探针，与转化植株RNARNA杂交，检查是杂交，检查是否有特异否有特异RNARNA带。带。4. 4. 蛋白质分子杂交（蛋白质分子杂交（Western blot 分析）分析）被转化植株提取的蛋白质与特异的抗体杂交，检查是否被转化植株提取

35、的蛋白质与特异的抗体杂交，检查是否有特异蛋白质带。有特异蛋白质带。三、转基因作物品种的选育（一）转基因作物育种目标的制定u依据不同的自然环境、栽培条件u落实具体性状目标u依据市场经济的需要和生产发展前景u要考虑品种的搭配u要充分考虑转基因作物，尤其是外援目的基因对人类健康和环境安全的影响 （四）转基因作物的安全性评价（1）转基因作物的环境安全性转基因作物演变为农田杂草的可能性 基因漂流到近缘野生种的可能性对自然生物类的影响（2）转基因作物的食品安全性(food safety) u有毒物质u过敏源 转基因产品具有一定的危险性，因此必须从对人类健康、社会安全和生态平衡的角度出发采取行之有效的措施：

36、加强转基因产品的安全性研究建立完善的检测体系与质量审批制度加强宏观调控加强对公众的宣传和教育为公众提供良好的咨询服务规范转基因产品市场第四节 分子标记与育种遗传标记：1.形态标记 简单、直观、数量少、多态性差、易受环境的影响；2、细胞标记 主要根据细胞染色体数目、大小、随体、着丝点等，数目有限；3、生化标记 包括同工酶和贮藏蛋白质，经济方便，但其标记数目有限，不能满足种子质资源鉴定与育种的要求。4.分子标记：以DNA多态性为基础的分子标记 （1）直接以DNA表现，表现稳定 （2）数量多 （3）多态性高 （4）表现为中性(无基因多效性），不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，

37、能区别 纯合体和杂合体。 （6）成本不太高引物 是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。探针探针是一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷-32）、萤光染料或者酶（如辣根过氧化物酶）标记成为探针。磷-32通常被掺入组成DNA的四种核苷酸之一的磷酸基团中，而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连 当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸（DNA或RNA）序列通过氢键紧密相连，随后，未被杂交的多余探针被洗去。最后，

38、根据探针的种类，可进行放射自显影、萤光显微镜、酶联放大等方法来判断样品中是否，或者何位置含有被测序列（即与探针互补的序列）。PCR技术基本原理 PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结

39、合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。多聚酶链式反应多聚酶链式反应（PCR） A T G A C G A T C G A G T A T A C T G C T A G C T CACT GPCR的指数扩增的指数扩增一、分子标记的类型 (一)基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离

40、不同的生物 DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 RFLPRFLP(Restriction(Restriction Fragment Length PolymorphismFragment Length Polymorphism，) )RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。 通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针

41、进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为14个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。 ( (二二) )基于基于PCRPCR技术的分子标记技术技术的分子标记技术1 1、随机引物的、随机引物的PCRP

42、CR标记标记所用引物的核苷酸序列是随机的，其扩增的 DNA 区域事先未知。随机引物PCR扩增的 DNA 区段产生多态性的分子基础是模板 DNA 扩增区段上引物结合位点的碱基序列的突变，不同来源的基因组在该区段上表现为扩增产物有无差异或扩增片段大小的差异。随机引物PCR标记表现为显性或共显性。随机扩增多态性随机扩增多态性DNA RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)基本原理：它是利用随机引物（一般为810bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。 RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物