转录调控-研究生教学课件

1、 周周 建建 林林一、真核生物基因表达调控的特点一、真核生物基因表达调控的特点(略略)二、真核生物基因转录调控二、真核生物基因转录调控三、真核生物基因转录调控的研究方法三、真核生物基因转录调控的研究方法转录水平的调控转录水平的调控n顺式作用元件顺式作用元件(cis-acting element)n反式作用因子反式作用因子(trans-acting factor)顺式作用元件顺式作用元件n是指对基因表达有调控活性的是指对基因表达有调控活性的DNA序列，其序列，其活性只影响与其自身同处于一个活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上分子上的基因的基因n非编码序列非编码序列n分为：启动子、增强子、沉默

2、子、绝缘分为：启动子、增强子、沉默子、绝缘子子反式作用因子反式作用因子trans-acting factor概念：通过识别和结合顺式作用元件的核心序列概念：通过识别和结合顺式作用元件的核心序列,而调控靶基因的转录效率的一类蛋白因子（转而调控靶基因的转录效率的一类蛋白因子（转录因子），对基因表达调控可正录因子），对基因表达调控可正(激活激活)可负可负(阻阻遏遏) 。 n类别：基本转录因子、上游转录因子和可诱导类别：基本转录因子、上游转录因子和可诱导转录因子转录因子 启动子启动子(Promoter) 概念：启动子是基因序列中决定转录起始的部位。概念：启动子是基因序列中决定转录起始的部位。包括核心启

3、动子和上游启动子元件包括核心启动子和上游启动子元件 。 一个基因可同时拥有一个及以上启动子；一个基因可同时拥有一个及以上启动子； 一般在转录起始点上游一般在转录起始点上游, 位于位于(+1)及及5端上游端上游100200b左右，是决定转录起始点及转录频率的关键左右，是决定转录起始点及转录频率的关键元素。元素。 ； 可与增强子共同控制转录起始和强度；可与增强子共同控制转录起始和强度； 发挥功能时除需发挥功能时除需RNA聚合酶外，还需转录调控因子聚合酶外，还需转录调控因子与启动子区各种调控元件相互作用。与启动子区各种调控元件相互作用。 1.核心启动子：RNA pol转录起始所必须的最少的DNA序列

4、，作用是确定转录起始点并产生基础水平转录。 2.上游启动子元件 包括-70bp的CAAT盒,GC盒,其他距起始转录点更远的上游元件。 与TFD结合成复合物后提高转录频率。启动子的研究方法启动子的研究方法研究内容研究内容：1、 转录起始位点的确定转录起始位点的确定2 2、启动子区域（、启动子区域（顺式作用元件顺式作用元件）的确定）的确定3 3、转录因子（、转录因子（反式作用元件反式作用元件）结合位点的确定）结合位点的确定4 4、反式作用元件和顺式作用元件相互作用、反式作用元件和顺式作用元件相互作用对基因转录的影响对基因转录的影响1、转录起始位点（转录起始位点（TSSTSS）的确定）的确定生物信息

5、学预测生物信息学预测TSS5 -RACE初步确定初步确定TSS的大概位置的大概位置引物延伸、核酸酶保护或引物延伸、核酸酶保护或S1作图精确定位作图精确定位TSS推荐使用推荐使用Gene2Promoter 软件（软件（ http:/www.genomatix.de） 和和TSSW、TSSG（http:/ （ http:/www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot ）/FirstChoice RLM-RACE Kit (Ambion)GeneRacer RLM-RACE Kit (Invitrogen )SMART RACE cDNA Amplification (Clontech)

6、 Primer extension(引物延伸)S1 nuclease mappingRNA 5DNA 3*53RNA 5DNA 353PAGE AnalysisAdd S1 nucleasePrimer extension and S1 nuclease digestion2 2、启动子区域的确定、启动子区域的确定生物信息学预测启动子区域生物信息学预测启动子区域缺失突变缺失突变 荧光素酶活性分析荧光素酶活性分析克隆克隆5 -flanking sequence并连接到报告基因载体上并连接到报告基因载体上确定转录调控区域（启动子区域）确定转录调控区域（启动子区域）3 3、转录因子结合位点的确定、转

7、录因子结合位点的确定(1)生物信息学预测转录因子结合位点生物信息学预测转录因子结合位点(2)实验证实转录因子结合位点：实验证实转录因子结合位点：EMSA/gel-shift, super shiftChIPDNase I footprinting 推荐使用推荐使用MatInspector 软件软件（ http:/www.genomatix.de）Mapper /mapper/mapper-topJaspar http:/ for evolutionary conserved transcription factor binding sites. nrVist

8、a 2.0 (/)nConSite (http:/ )Gel retardation(凝胶阻滞凝胶阻滞)/electrophoretic mobility shift assay (EMSA, 电泳迁移率变动分析电泳迁移率变动分析) ChIP（染色质免疫共沉淀（染色质免疫共沉淀）4 4、反式元件与顺式元件的相互作用对转录、反式元件与顺式元件的相互作用对转录的影响的影响（1）定点突变）定点突变荧光素酶活性分析荧光素酶活性分析（2）过表达转录因子）过表达转录因子测定目的基因的表达测定目的基因的表达（3）干扰转录因子的表达）干扰转录因子的表达测定目的基因的

9、表达测定目的基因的表达（4）转基因动物）转基因动物定点突变定点突变增强子（增强子（enhancer） r基因组中能增强邻近基因启动转录的序列。最早基因组中能增强邻近基因启动转录的序列。最早发现于发现于SV40的基因上游，含的基因上游，含2个个72bp的正向重复的正向重复序列。序列。r增强子特性增强子特性 1.增强效应非常明显增强效应非常明显 10200倍倍 。 2.与其位置、取向无关（上下游、距离）与其位置、取向无关（上下游、距离） 3.核心序列是重复序列核心序列是重复序列,是增强效应所必须是增强效应所必须 4.有细胞组织特异性，有细胞组织特异性， 需与特异蛋白因子作用需与特异蛋白因子作用 5

10、.无基因特异性无基因特异性 6. 要有启动子才能发挥作用要有启动子才能发挥作用Bulger and Groudine. 2002. Nature Gen. 32:555-557Models for Enhancer Action consists of several good binding sites of TFs the sites are spatially clustered together the pattern of sites is conservedCharacterization of an enhancer?Enhancer Element Locator http:/

11、www.cs.helsinki.fi/u/palin/EEL/ Assays for EnhancersTransient transfectionDNAase I hypersensitivityDNAase I footprinting/mutation analysisTransgenic miceTransient Transfection:PLuciferaseEPLuciferaseEPLuciferase Insulator (绝缘子) 一种负调控元件，参与基因表达的负调控。一种负调控元件，参与基因表达的负调控。干扰增强子与启动子的相互作用，并抑干扰增强子与启动子的相互作用，并抑

12、制启动子的激活活性。制启动子的激活活性。3.7Insulator function in ImprintingTwo linked Imprinted Genes:Maternal H19 (on), Igf2 (off) Paternal H19 (off), Igf2 (on)H19Igf2Effects of insulators on enhancerpromoter interactionsnCTCFBSDB: a CTCF binding site database for characterization of vertebrate genomic insulators : /CTCF is the only protein identified so far in vertebrate that binds to insulators and shows enhancer-blocking activity CTCF vs. BORISnCTCFn11个与DNA结合的锌指结构域 n与绝大多数的ICRs以及CpG岛结合 n结合是甲基化敏感的n具有绝