HPLC法测定民族药露水草中β-蜕皮激素的含量

1、HPLC法测定民族药露水草中-蜕皮激素的含量HPLC法测定民族药露水草中-蜕皮激素的含量2349202103-0070-0520-羟基蜕皮甾酮20-Hydroxy ecdysterone又称-蜕皮激素-ecdysone，是一种昆虫的变态激素，可用于防治害虫及提高虾蟹产量1。化学式为C27H44O72。其不仅能促进昆虫变态，还具有许多药理活性3。具有促进细胞生长、刺激真皮细胞分裂、产生新的生命细胞和生殖细胞的作用4。还可促进动物的生长发育，促进细胞增殖分化，促进蛋白质、碳水化合物、脂肪代谢，爱护神经系统、心血管系统、肝脏等成效5。其主要作用是促进核酸和蛋白质的合成，影响糖代谢和脂类代谢，免疫调整

2、机体。高剂量的蜕皮激素能扰乱昆虫体内的正常代谢过程，所以用于防治害虫6。在运动保健方面，-蜕皮激素具有显著的通过增加氨基酸装配成蛋白链，从而刺激肌肉细胞质中蛋白质合成的能力，而且该能力回溯至蛋白质生长的转译和转移的过程7。蜕皮甾酮类甾体化合物广泛的存在于不同科属的植物中8。迄今为止，露水草是昆明植物所聂瑞麟先生发觉的自然界中含植物甾酮类成分最丰富的药用植物之一9。本次试验选用露水草为提取原料。露水草Cyanotis C.B.Clark又名珠宝露水草、换肺散、鸡冠参等，为鸭跖草科Commelinacede蓝耳草属多年生宿根性草本，分布于中国、印度、斯里兰卡及中南半岛，我国主要分布于云南、贵州、广

3、西、广东、福建、台湾等省区海拔11001700 m的山沟、山坡林缘或林中10。综合试验室条件等各种缘由，此次试验接受高效液相色谱法HPLC测定-蜕皮激素的含量。1仪器与试药1.1仪器梅特勒托利多万分之一电子天平型号 MS204;电热鼓风枯燥箱型号 101-0EBS;超声清洗仪器型号 CPXS800H-C;安捷伦高效液相色谱仪型号 1260 DAD UV检测器。1.2试药露水草全草干草;-蜕皮甾酮对比品批号：111638-202104，含量以按95.8%计，中国食品药品检定讨论院;乙腈、甲醇色谱纯;其他化学试剂为分析纯;水为超纯水。2方法条件的选择与结果2.1检测波长确实定周密称取-蜕皮甾酮对比

4、品26.10 mg，加甲醇定容至50 mL量瓶，摇匀，即得浓度为每1 mL含-蜕皮甾酮0.5001 mg的对比品贮备液。周密吸取上述溶液3 mL置50 mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对比品溶液浓度为30 g/mL。取样品0.2 g至50 mL容量瓶，加甲醇25 mL，超声40 min，取出，放冷至室温，定容至刻度，作为供试品溶液。取上述供试品溶液及对比品溶液，在乙腈-水15：85、乙腈-甲醇-水14：28：58、甲醇-水40：60三种流淌相中分别进样，DAD UV HPLC色谱仪在波长200600 nm扫描，得出最大汲取波长。结果显示对比品溶液及供试品溶液均在=248 nm处有最大汲取

5、，且无杂峰干扰，因此后续试验检测波长确定为248 nm。2.2色谱柱的选择选用4.6 mm×250 mm，粒径5 m色谱柱测量时，保存时间接近半小时，用时过长，且保存时间波动较大，峰面积不稳定，所以选择4.6 mm×150 mm，粒径5 m色谱柱，短柱保存时间在5 min左右，相比之下，缩短了试验时间，且峰面积与长柱相比较稳定。选择出4.6 mm×150mm色谱柱。2.3样品提取方法的选择本试验接受超声提取40 min、振荡提取40 min及索式提取至无色三种方式进行提取，结果显示接受索式提取-蜕皮甾酮含量相对较高;但预试验时索式提取四份样品周密度较差，提取近14

6、 h才至无色比较费时且存在温度难控等因素，相较于超声及振荡提取，-蜕皮甾酮含量相近，但考虑到操作性，最终接受超声提取。2.4提取溶剂确实定本试验接受甲醇、乙醇两种溶剂通过超声提取40 min、振荡提取40 min及索式提取至无色三种提取方式提取，三种提取方式结果都显示甲醇溶剂提取时含量相对较高，最终确定接受甲醇溶剂提取。2.5流淌相确实定预试验时标准品以及三种方法提取所得的样品都分别在检测波长248 nm，三种流淌相乙腈-水15：8511、乙腈-甲醇-水14：28：58、甲醇-水40：6011条件下进样。通过对比保存时间、色谱汲取峰峰型以及峰面积，乙腈-水15：85为流淌相时出峰时间相对另外两

7、种较长;乙腈-甲醇-水14：28：58为流淌相时分别度达不到要求;甲醇-水40：60为流淌相时保存时间相对较短，峰形较好，峰面积较稳定，所以确定以甲醇-水40：60为流淌相。 2.6柱温确实定试验期间，环境温度的改变对保存时间影响较大，不同的环境温度会导致保存时间的波动。温度降低时，保存时间提前，温度升高时保存时间往后延，最大与最小保存时间相差超过0.5 min，所以将柱温从30 调为35 ，且保持进样过程中环境温度波动较小，此条件下进样，保存时间仍有改变，但在0.4 min范围内，峰面积改变有较大改观。3溶液的配制3.1样品溶液样品前处理：将露水草植物样品打粉后过3号筛50目，备用。取露水草

8、样品0.2 g至50 mL容量瓶，加甲醇25 mL，超声40 min，取出，放冷，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，经0.45 m微孔滤膜滤过，即得。3.2标准品溶液3.2.1浓度为0.5000mg/mL对比品溶液周密称取-蜕皮甾酮对比品26.10 mg，加甲醇定容至50 mL量瓶，摇匀，即得浓度为每1 mL含-蜕皮甾酮0.5001 mg的对比品贮备液。3.2.2浓度为0.2000mg/mL对比品溶液周密称取-蜕皮甾酮对比品41.75 mg，甲醇定容至200 mL量瓶，得0.2000 mg/mL对比品溶液。3.3阴性对比溶液取不含-蜕皮甾酮的空白样品，照供试品溶液制备方法制备，即得阴性对比溶液

9、。4色谱条件色谱柱：Agilent Extend-C18柱4.6 mm×150 mm，粒径5 m，柱温：35 ;流淌相：甲醇-水40：60;流速1 mL/min;进样量5L;检测波长：248nm。5检测方法及结果5.1专属性考察根据上述色谱条件，分别吸取三一、二、三项下溶液即供试品溶液、对比品溶液阴性对比溶液，各5 L注入色谱柱，采集色谱图。阴性对比品色谱在对比品出峰位置上无干扰峰，即本试验条件下对测定干扰较小，系统误差较小。对比品图谱-蜕皮甾酮Rt=5.166 min。样品图谱-蜕皮甾酮Rt=5.091 min，且它们的分别效果都良好。5.2线性范围考察取三.二.1中0.5001

10、mg/mL的对比品贮备液，周密量取8 mL置10 mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，照此方法依次稀释，得到浓度为0.400 mg/mL、0.300 mg/mL、0.200 mg/mL、0.100 mg/mL、0.050 mg/mL、0.025 mg/mL對照品溶液。吸取上述各浓度的对比品溶液及0.5001 mg/mL的对比品溶液分别进样5 L;按上述色谱条件测定峰面积，每个浓度各进样2针。结果见表1。以-蜕皮甾酮浓度Cmg/mL为横坐标，平均峰面积A为纵坐标，进行线性回来。线性回来方程为：y=7569x+9.858，r=0.9999x：mg/mL，结果说明，在0.025 mg/mL0.5 mg

11、/mL浓度范围内与峰面积线性关系良好。5.3重复性按3.1项下操作，平行配制6份供试品溶液，按上述色谱条件测定，每份进样2次。结果-蜕皮甾酮的峰面积无显著差异，其相对标准偏差RSD值为0.4%RSD值2%，说明该方法重复性良好，结果见表2。5.4周密度按3.2.1项下操作分别配制两份浓度为0.2 mg/mL标准品溶液，按上述色谱条件测定峰面积，每份重复进样5次，其相对标准偏差 RSD值分别为0.2%和0.3%，小于2%，故本试验的周密度满足要求的规定。结果见表3。5.5稳定性取同一供试品溶液按上述色谱条件在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h进样5 L，测定峰面积及RSD，结果峰

12、面积改变不大，相对标准偏差RSD值为0.6%，小于2%，说明样品溶液在24 h内没有明显的改变是稳定的。结果见表4。5.6样品含量测定按3.1项下操作制备供试品溶液3份，按上述色谱条件测定，每份进样2次，计算含量本品含量按枯燥品计算结果如表5。5.7加样回收率试验周密称取已知含量的露水草样品6份每份约取0.1 g，再分别周密加入3.2.2项下对比品溶液25 mL，超声40 min，取出，放冷，定容至刻度，摇匀，滤过，按上述色谱条件测定，每份进样2次，测得回收率介于100.0%105.0%之间，RSD值为1.0%2%，说明回收率良好，结果见表6。6结论本试验接受DAD UV HPLC色谱法测定样

13、品中-蜕皮甾酮的含量，本检验方法得到的标准工作曲线相关系数为0.9999，周密度的RSD值小于2%，重复性的RSD值0.4%，样品含量为0.0543g/g，加标回收率在100.0%105.0%间。该方法适用于-蜕皮甾酮的含量测定7商量7.1检测波长确实定测定进行前，汲取波长的选择至关重要。为确定-蜕皮甾酮含量测定的检测波长，通过DAD UV高效液相色谱仪及紫外可见分光光度计扫描确定。紫外可见分光光度计检测以甲醇为空白对比，取对比品溶液及供试品溶液，在200400 nm波长范围内扫描，结果对比品溶液在240 nm处有最大汲取波长，供试品在248 nm处有最大汲取;DAD UV高效液相色谱仪测定时在200600 nm波长范围内扫描，结果对比品溶液及供试品溶液均在248 nm处有最大汲取。此时存在差异，但由于时间缘由及本试验