氧氟沙星葡萄糖注射液的无菌检查进行方法学验证

1、.1试验目的：对氧氟沙星葡萄糖注射液的无菌检查进行方法学验证及对供试品进行无菌检查。1036.2试验仪器及药品：103621试验仪器：HT-1300超净工作台苏净集团苏州安泰空气技术生化培养箱广东医疗器械厂HTY-皿智能集菌器杭州高得医疗器械KSF集菌培养器杭州高得医疗器械10.3.6.2.2 供试品和试剂：103622.1培养基：硫乙醇酸盐流体培养基用于好氧菌和厌氧菌、改良马丁培养基用于真菌、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基均由中国生物制品检定所提供103622.2菌种：均由中国生物制品检定所提供菌种名称菌株编号对应培养基金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CMCC

2、(二1 26 003 硫乙醇酸盐流体培养基铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa CMCC(10 104 硫乙醇酸盐流体培养基枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CMCC(J 63 501硫乙醇酸盐流体培养基生孢梭菌Clostridium sporogenes CMCC(64 961硫乙醇酸盐流体培养基白色念珠菌 Candida albicans CMCC(F) 98 001 改良马丁培养基黑曲霉菌Aspergillus niger CMCC(F) 98 003 改良马丁培养基供试品：氧氟沙星葡萄糖注射液本公司自制规格：100ml :,批号：0502022、050

3、2021、0502031稀释液、冲洗液及溶解液的制备：0.1%蛋白胨水溶液 取蛋白胨，加水 1000ml ，微温溶解，滤清，调节 pH 值至 7.1 ±0.2， 分装，灭菌。0.9%无菌氯化钠注射液 取0.9%氯化钠注射液500ml/瓶1瓶，灭菌保存。10.3.6.3.1 无菌性检查每批培养基随机取 6 瓶，在各自条件下培养 14 天，逐日观察，结果均无好氧菌、厌氧菌 和真菌生长，符合无菌要求。10.3.6.3.2 灵敏度检查10.3.6.3.2.1 菌液制备10.3.6.3.2.1.1 接种金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉 汤培养基中，33士 C培养

4、18h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成1: 103、1: 104、1: 105、1 : 106、1： 107，再分别取1ml于培养基中，在33 C ±0.5生化培养箱培养48h，计数， 选择1ml含菌数少于100cfu菌落形成单位的菌悬液；接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，33 士C培养24h,接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中， 26士C培养48h ,上述培养物用0.9% 无菌氯化钠溶液稀释成 1: 103、 1: 104、 1: 105、 1: 106、 1: 107，再分别取 1ml 于培 养基中，分别在33 °C ±0.5生化培养

5、箱48 h和26士 C生化培养箱培养72h，计数，选择 1ml含菌数少于100cfu菌落形成单位的菌悬液；接种黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁培养琼脂斜面培养基上，26 士C培养7 天，参加 5ml0.9% 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液至无菌试管中，用 0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu菌落形成单位的孢子悬液。培养基接种：在无菌条件下，依照中国药典2005年版二部附录幻H无 菌检查法项下具体步骤操作，细菌培养 3天，真菌培养 5 天，逐日观察。结果见下表。 培养基的灵敏度试验结果培养基 菌种 培养天数 结果乙醇酸盐流体培养基 12ml/ 支 金黄色葡萄球

6、菌 3 生长良好3 生长良好铜绿假单胞菌 3 生长良好3 生长良好枯草芽孢杆菌 3 生长良好3 生长良好生孢梭菌 3 生长良好3 生长良好空白对照 3 无菌生长改良马丁培养基9ml/ 支 白色念珠菌 5 生长良好5 生长良好黑曲霉菌 5 生长良好5 生长良好空白对照 5 无菌生长结果说明：培养基的灵敏度符合规定。10.3.6.4 方法验证试验10.3.6.4.1 菌液制备：同灵敏度试验试验项下菌液制备。10.3.6.4.2 方法及结果检查方法：用15ml0.1%蛋白胨水溶液润湿滤膜，然后取氧氟沙星葡萄糖注射液30支，通 过集菌培养器的滤器过滤，均分在 6个滤器中，每个滤器再用 0.1%蛋白胨水

7、溶液 100ml/ 次冲洗，共 5 次，在最后一次的冲洗液中分别参加小于 100cfu 的试验菌，过滤。根据试 验菌的要求将硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基参加滤筒内。另取一装有同体积培 养基的容器，参加等量试验菌，作为对照组。按规定培养 3 天。各批样品同法操作。结果 见下表。菌种 批号 出现微生物生长的最长时间天供试品组 阳性对照组金黄色葡萄球菌 0502022 20502021 20502031 2铜绿假单胞菌 0502022 20502021 20502031 2枯草芽孢杆菌 0502022 20502021 20502031 2生孢梭菌 0502022 20502021 2050

8、2031 2白色念珠菌 0502022 30502021 30502031 3黑曲霉菌 0502022 30502021 30502031 3 结果说明：各验证菌在含供试品的培养基中生长良好，且同一微生物在含供试品的培养基 中与在阳性对照中的生长时间没有明显的差异，说明该供试品的该检验量在该检验条件下 无明显抑菌作用，即本法适用于供试品的无菌检查。10.3.6.5. 供试品无菌检查10.3.6.5.1 试验方法 同验证方法，但观察时间为 14 天。 供试品组：氧氟沙星葡萄糖注射液 10 支。阳性对照组：氧氟沙星葡萄糖注射液 5 支、金黄色葡萄球菌小于 100cfu 阴性对照组 1硫乙醇酸盐流体培养基 ：除供试品用等量 0.1% 蛋白胨水溶液取代外，其 余相同。阴性对照组 2改良马丁培养基：除供试品用等量 0.1% 蛋白胨水溶液取代外， 其余相同 各批样品同法操作。10.3.6.5.2 结果培养基 批号 样品管 菌生长情况硫乙醇酸盐流体培养基 0502022 供试品管 无菌生长阳性对照管 菌生长良好0502021 供试品管 无菌生长阳性对照管 菌