化合物黄酮提取以及检测方法的研究

1、化合物黄酮提取以及检测方法的研究黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物, 在银杏叶、山楂、杜仲、山香圆叶、水芹、竹叶、黄芪、丹参等植物中均有检出。到目前为止, 已经发现有5000 多种植物中含有黄酮类和异黄酮类化合物1。黄酮类化合物的结构特点是具有C6- C3- C6 的基本骨架,根据中间三碳链的氧化程度、B 环( 苯基) 连接位置( 2-或3- 位) 以及三碳链是否呈环状等特点, 分为许多不同类型: 包括黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、二氢异黄酮、查尔酮等化合物2。现代研究证明黄酮类化合物是重要的抗氧化剂, 其生理作用是多种多样的, 例如芦丁、槲皮素等能够增强心脏收缩; 杜

2、鹃素具有止咳祛痰作用; 黄芩苷具有抗菌消炎、抑制肿瘤细胞作用; 水飞蓟素具有保肝作用等3; 此外, 黄酮类化合物还有降血脂、止血、抑制血小板聚集等多种药理作用。正是其上述生物活性引起了人们的广泛重视, 对该类化合物的研究已成为国内外医药界研究的热门课题, 是一类具有广泛开发前景的天然药物4。黄酮类化合物在人体不能直接合成, 只能从食品中获得。主要是作为食品添加剂或直接应用于食品中增加其保健作用。例如茶多酚在功能食品中的应用主要是以茶叶及其提取物的形式添加到食品中。茶多酚具有抗疲劳、抗辐射、抗衰老等功能特性, 茶叶具有独特的色、香、味、形, 能使食品增香、调味、着色, 因此茶多酚以茶叶的形式在食

3、品中的应用十分广泛。近年来科学家都积极关注从植物体中提取纯度高、活性强的天然黄酮成分, 并进一步将其加工成有特异功能的保健食品和药品等产品。1 黄酮类化合物的提取方法1.1 有机溶剂提取法甲醇和乙醇是最常用的黄酮类化合物提取溶剂,高浓度的醇( 如90 %左右) 适宜于提取苷元, 60 %左右浓度的乙醇或甲醇水溶液适宜于提取苷类。田呈瑞5采用索氏提取法, 利用乙醇提取银杏叶黄酮, 通过单因素试验和正交试验, 确定乙醇提取银杏叶总黄酮的最佳条件为: 银杏叶粉碎至50 目60 目, 以70 %乙醇按照液固比61 的比例, 于80 条件下提取2 次, 每次1 h,银杏叶总黄酮提取率可达87.6 %。此

4、外, 欧美国家采用的主要溶剂法工艺有: 醇(酮)浸提- 卤代烃萃取- 酮/铵盐萃取法、酮浸提- 氨水沉淀- 混合酮萃取法、酮浸提-综述154食品研究与开发2008 年1 月第29 卷第1 期卤代烃萃取- 铅化物沉淀法和醇(酮)浸提- 甲苯/丁醇萃取树脂法6。该工艺采用中等温度50 60 浸泡, 杂质较少, 经浓缩、水析可除去烷基酚等脂溶性物质, 用CCl4 等非极性溶剂萃取除去蜡质、叶绿素等脂溶性杂质; 调节pH89 或Pb( OH) 2 沉降, 可除去原花青素、蛋白质、高分子单宁等杂质, 加入( NH4) 2SO4 等盐, 增加相密度, 有利于C4- C6 酮和醇萃取有效成分和减少乳化现象,

5、 改善分层, 提高有效成分的萃取率7。1.2 微波提取法微波加热是透入内部的能量被物料吸收置换成热能对物料的加热, 形成独特的物料受热方式, 具有均匀性的特点, 同时具有反应高效性和强选择性等特点, 而且操作简便, 副产物少, 提取率高及产物纯度高等优点。本法多用在药材的浸出, 在黄酮类化合物的提取上取得了良好的效果。段蕊8等人对微波法提取银杏叶中黄酮类物质进行研究, 用175 W 微波强度处理5 min后, 以体积分数80 %的乙醇, 在70 提取1 h, 得到提取物的黄酮类物质质量浓度比未经微波处理的高出18.8 %。此外李嵘与金美芳9在以水为介质的条件下,对银杏叶进行微波处理, 提取效果

6、与传统方法对照, 表明此方法提取率高, 省溶剂, 大大提高了提取效率。实验方法是称取100 g 银杏叶丝, 加160 mL 蒸馏水, 微波解冻处理5 min 及15 min, 提取液以440 mL60 %乙醇,55 回流提取。结果表明, 微波处理后进行乙醇水浸提比同样方法未用微波处理可以提高银杏叶中有效成分的提取率达22.6%, 而且大大缩短了提取所需时间。1.3 超临界萃取法超临界流体萃取是利用超临界流体在临界压力和临界温度附近具有的特殊性能作为溶剂进行萃取的一门科学, 最常用的超临界流体为CO2。应用CO2- SPE 技术提取分离黄酮类物质, 具有萃取速度快, 效率高, 操作简单等特点,

7、产品中没有残留有机溶剂, 与传统的萃取分离工艺相比优势是明显的。此外, 超临界CO2 萃取较易与其它先进技术联用, 成为新型而有效的分离分析技术。孙婷10利用超临界CO2 萃取法从银杏叶中提取黄酮类化合物, 确定了超临界流体萃取的最佳条件: 压力为20MPa, 萃取罐的温度为40 , 流量为14 mL/min,萃取时间为2 h, 在此条件下测得总黄酮的含量为29.1 %, RSD 为3.1%。张玉祥11通过正交试脸, 确定最优化的提取工艺是: 20 MPa 的压力下, 夹带剂15 %,50 萃取40 min, 含量测定显示, CO2 超临界流体萃取法能有效萃取银杏叶中的总黄酮和总内酯, 含量高

8、于欧洲( EGb761) 的质量标准。游海等人12在提取银杏叶中的黄酮类化合物药用活性成分的实验中, 确定了实验最佳条件: 萃取压力12 665.6 kPa, 萃取温度为45 ,萃取时间为30 min45 min, 分离压力为6 586.1 kPa, 其中黄酮含量达28%以上。1.4 酶浸渍萃取法最近几年, 随着酶技术的快速发展, 科学工作者充分利用了酶的特性发展了新的提取方法。酶浸渍法是指在黄酮提取过程中, 通过加入恰当的酶发生转糖反应和酶解反应而使产品黄酮得率和含量大大提高的新兴技术。传统的水提取只能提取水溶性黄酮, 致使类黄酮得率和含量过低; 此时如选用恰当的酶加入, 不仅可以将油溶性的

9、类黄酮转化为易溶于水的糖苷类而利于提取, 而且还可通过酶反应将植物组织分解, 使提取传质阻力减小; 另外也可使提取液中的杂质分解去除, 从而简化后续分离纯化工序。并且其提取条件温和, 有利于黄酮类活性保护, 且成本低、安全4。1.5 超声波辅助提取法用超声波法提取黄酮类物质, 是目前比较新的方法。其原理主要是利用超声波在液体中的空化作用加速植物有效成份的浸出提取。另外,还利用其次效应,如机械振动, 扩散, 击碎等, 使其加速被提取成份的扩散, 释放。超声波提取法大大缩短了提取时间, 提高了有效成分的提取率、原料的利用率。吴传茂13等用超声波振荡法提取大豆和豆豉中的大豆异黄酮苷元, 其提取方法最

10、佳方案是: 样品中加入100 %乙醇300 mL, 超声振荡30 min, 通过检测得出大豆中大豆黄素的含量为106.5 g/g, 染料木黄酮的含量为155.1 g/g; 豆豉中大豆黄素的含量为312.8 g/g, 染料木黄酮的含量为555.6 g/g。王延峰14等人研究了银杏叶黄酮的超声提取法, 并与连续热回流中的索氏提取作了比较研究, 最佳操作条作为超声波频率40 kHz, 处理时间10 min,静置时间12 h, 结果表明超声波法优于索式提取法。2 黄酮类物质的测定方法2.1 分光光度法黄酮类化合物多采用硝酸铝比色法测定。其基本原理是以芦丁为标准品, Al( NO3) 3 络合体系显色,

11、 全波段扫描在510 nm 处有最大吸收峰, 测定其吸光度, 以此来计算含量。罗宪堂15等人利用该法测定了山香圆叶中的黄酮类成分的含量, 但硝酸铝比色法专一性较差, 测定受处理过程颜色变化的影响。研究人员对此法进行了多项改进以提高其准确度。尉芹16等人在测定杜仲总黄酮的实验中认为绿原酸是主要干扰因素, 他们采用纸层析法将样品中的黄酮与绿原酸分离后, 再进行测定, 从而提高了测定的准确度。刘佳佳17等用硼综述1552008 年1 月食品研究与开发第29 卷第1 期酸- 柠檬酸比色法测定了银杏叶黄酮的含量。徐燕18以黄芩苷为对照品, 采用双波长分光光度法测定黄芩总黄酮含量。另外, 周荣琪19将过滤

12、法应用于竹叶黄酮测定中, 并对滤纸对于黄酮类物质的吸附进行了校对, 发现滤纸对黄酮类物质吸附甚微, 此方法应用于竹叶黄酮体系大大提高了测定稳定性, 且准确度较高, 重现性良好。2.2 纸色谱法纸色谱用于黄酮类分析选择性和重现性较差, 一般作为定性检测。余戟20采用高于临界胶束浓度( CMC)的十二烷基硫酸钠( SDS) , 溴化十二烷基甲基卞胺水溶液作展开剂, 通过纸色谱法分离和检测桑色素、杨梅黄素等8 种黄酮苷和苷元, 发现了适宜于分离其黄酮苷类的展开体系。2.3 薄层色谱法( TLC)薄层色谱又叫薄板层析, 是色谱法中的一种, 是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术, 属固-

13、液吸附色谱, 它兼备了柱色谱和纸色谱的优点, 一方面适用于少量样品( 1 g, 甚至0.01 g) 的分离; 另一方面在制作薄层板时, 把吸附层加厚加大, 因此, 又可用来精制样品。此法具有设备简单、操作方便、分离速度快等特点, 但离线操作使分辩率和重现性等不如高效液相色谱法和气相色谱法, 常被作为定性和半定量的手段。固定相一次性使用, 样品无需复杂处理, 分离物的性质不受限制, 应用广泛; 可同时平行分离多个样品, 测试速度快, 所需溶剂量少, 选择范围宽,并有不同展开方式, 有利于不同性质的物质分离; 此方法可以在同一色谱板上可根据组分性质选择不同显色剂或检测方法进行定性或定量; 薄层色谱

14、图像可提供原始彩色图像, 不仅便于保存原始图像, 而且可以提供较多信息, 直观性、可比性均较好都是此法的独特之处4。2.4 极谱法极谱分析是在特殊条件下进行电解分析, 其特殊性在于采用了一个面积很大的参比电极和一个面积很小的滴汞电极进行电解。孙仕萍21等为了测定保健食品中的黄酮含量, 探讨用单扫示波极谱法测定总黄酮含量的快速方法, 以芦丁为对照品, 建立了良好的直线关系。2.5 气相色谱法气相色谱法( GC) 具有进样量少、高灵敏度、高选择性、高特异性等优点; 但需样品需要衍生, 步骤较为复杂, 耗时长, 且仪器较为昂贵, 从而限制该法推广应用。Liggins 等22采用毛细管- 质联法测定8

15、0 余种蔬菜和坚果中大豆黄素和染料木素, 其中36 种含有被测物质, 而大豆中大豆黄素和染料木素总含量达2 g/kg。孙艳梅23选取SE- 30 毛细管柱, 在柱温为恒温260 时,利用气相色谱法, 进行了大豆- 葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷的研究, 确定黄豆苷元含量工作曲线方程为Y=71 519X- 85 913, X 为黄豆苷元的含量( g/L) , 相关系数R2=0.993 7。2.6 高效液相色谱法( HPLC)HPLC 分析黄酮类化合物, 正相系统一般采用乙烷或异辛烷等体系为流动相, 以极性较大的乙醇、丙醇、乙腈等有机溶剂调节。反相体系则一般优先选择甲醇/水及乙腈/水体系为流动相,

16、还需要加入酸调节pH,抑制解离, 克服拖尾现象。为了提高分离度需要梯度洗脱, 多用C18 柱分离。胡芳弟24以甲醇- 水为流动相, 梯度洗脱, 在254 nm 检测波长下测定黄芪中黄芪甲苷和2 个黄酮类化合物含量。刘斌25建立了苦参汤有效部位中4 种黄酮类成分的HPLC 含量测定方法。此外郑莹26等人使用反相高效液相色谱法对三七叶中的黄酮类化合物进行了含量测定。其方法为: 使用ZORBAX Extend C8 柱( 250 mm4.6 mm, 5 m) , 流动相为甲醇-0.15 %乙酸水溶液( 3565) , 流速1.2 mL/min, 检测波长268 nm, 柱温25 。实验结果如下: 山

17、柰酚- 3- O- BD-半乳糖葡萄糖苷与槲皮素- 3- O- B- D- 半乳糖葡萄糖苷在进样量0.5 g20 g 范围内均有良好的线性关系, 相关系数r2 皆为0.999 9。池静端27等人用反相高效液相色谱法测定了银杏叶中6 种黄酮成分即槲皮素、异鼠李素、山萘酚、白果黄素、银杏黄银杏黄素、西阿多黄素。色谱柱为ZORBAX ODS 柱, 流动相: 甲醇以及THF- H2O- HCOOH( 34651) , 梯度洗脱, 流速:1.0 mL/min, 检测波长: 350nm, 线性范围0.10g2.57g,相关系数2= 0.999 40.999 8, 回收率98.0 %102.0 %。2.7

18、液相色谱与质谱联用法液相色谱- 质谱( LC-MS) 成为现代实验室一种确定的分析工具, 是由于它相对于通常的检测方式, 能提供更优越的选择性和更低的检测限, 对混合物的分析有很高的灵敏度和选择性以及广泛的适用性, 可大大缩短分析时间, 减少原料的浪费。马强28等人采用高效液相色谱与电喷雾质谱联用技术研究了红车轴草中的异黄酮类化合物。实验采用反相C18 色谱柱, 二元线性梯度洗脱, 分离并检测了红车轴草中的14 种异黄酮类化合物; 通过与电喷雾质谱联用获得了相应化合物的分子量信息, 并利用质谱的源内碰撞诱导解离技术鉴定这些化合物的可能结构。董淮海29等人应用高效液相色谱- 电喷雾质谱联用法,

19、直接对大豆胚芽的70 %乙醇室温提取液进行检测。根据各色谱峰的质谱特征,综述156食品研究与开发2008 年1 月第29 卷第1 期在室温提取液中鉴定出9 种异黄酮, 7 种A 组皂苷,4 种B 组皂苷和2 种E 组皂苷。肖贻菘30等人使用液相色谱- 质谱联用技术对苦竹叶中的黄酮类化合物进行了分析。结果证明对于复杂天然产物的定性定量分析, 高效液相色谱- 电喷雾质谱( HPLC/ESI-MS)联用分析法是一种方便快捷有效的方法。2.8 毛细管电泳法毛细管电泳以高效、快速、进样量少、重现性好、不易污染等优点, 近几年用于分析天然产物得到较大的发展。陈刚31等人用毛细管电泳电化学检测法测定了葛根和

20、葛藤中葛根素、大豆甙元和芦丁含量。以碳圆盘电极为检测电极, 电极电位为0.90 V( VS.SCE) , 在50 mmol/L 硼酸盐缓冲液( pH=9.0) 中, 使用长40 cm 熔融石英毛细管。当分离电压为9 kV, 上述三组分在12 min 内完全分离。此外, 吴婷32等人用毛细管电泳-电化学检测( CE- ED) 法同时测定了益母草及3 种益母草冲剂中的根皮苷、橙皮素、芦丁、山奈酚、洋芹素和槲皮素6 种黄酮类化合物的含量。采用300 m 碳圆盘电极为工作电极, 检测电位为+0.95 V( VS.SCE) ,在80 mmol/L 的Na2B4O7- H3BO3 ( pH=8.7) 的运

21、行缓冲液中, 上述各组分在20 min 内能完全分离。3 结语黄酮类化合物的主要提取方法是有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波提取法、超临界CO2 萃取法、酶浸渍萃取法。超临界萃取法速度快、操作简单, 产品无溶剂残留; 超声波辅助提取无需加热, 对有效成分具有保护作用。在提取某些中草药黄酮类成分时, 可以将二者合理地结合利用。测定方法有比色法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱- 质谱联用法、以及毛细管电泳法。比色法适于测定总黄酮, 但不适用于单一成分的测定。高效液相色谱是测定黄酮类化合物的有效方法。它克服了传统定量方法繁琐、费时、分离度欠佳以及GC 法的拖尾现象或制成相应衍生物操作繁

22、琐等缺点, 分离效率高, 在该类化合物中的应用日趋增多。高效液相色谱- 质谱联用法为黄酮类化合物的指纹图谱的建立提供了高效准确的方法。毛细管电泳以高效、快速、进样量少、节省溶剂、重现性好、不易污染等优点, 近几年在黄酮类化合物的分析中得到了较大的发展。由于黄酮类化合物具有降压、降血脂、镇痛、抑制血小板聚集、抗骨质舒松、抗心律失常、抗过敏及抗缺氧等多种药理及保健作用, 而且黄酮类化合物在人体不能直接合成, 只能从食品中获得, 所以近年来科学家都积极关注从植物体中提取纯度高、活性强的天然黄酮成分。因此, 对黄酮类化合物的提取以及测定方法的研究具有广泛的前景。参考文献:1 蔡健, 华景清.黄酮提取工

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