计算药物分析(药学与生物信息学)第七章

1、第第7章章 计算分光光度法计算分光光度法中国药科大学中国药科大学Contents对照品比较法吸收系数法计算分光光度法计算分光光度法中华人民共和国药典（中华人民共和国药典（2005年版）年版）二部附录二部附录A 紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法中国药科大学中国药科大学中国药科大学中国药科大学中国药科大学中国药科大学二部收载二部收载:、复方磺胺嘧啶片、复方磺胺嘧啶片 （磺胺嘧啶（磺胺嘧啶+甲氧苄啶）甲氧苄啶） 复方磺胺甲恶唑片（磺胺甲恶唑复方磺胺甲恶唑片（磺胺甲恶唑+甲氧苄啶）甲氧苄啶） 双波长法双波长法(等吸收点法，对照品等吸收点法，对照品)、 维生素维生素A及其制剂及其制剂 三波长校正法

2、三波长校正法 （二部附录（二部附录 J 维生素维生素A测定法）测定法）优点优点: 不经分离直接测定多组分；不经分离直接测定多组分； 简便简便局限性局限性: 重现性差重现性差中国药科大学中国药科大学药典二部附录药典二部附录A规定（规定（2000）采用计算分光光度法应慎重。本法有多种，使用时均应按采用计算分光光度法应慎重。本法有多种，使用时均应按照各品种项下规定的方法进行。照各品种项下规定的方法进行。当吸收度在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时，波当吸收度在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时，波长的微小变化可能对测定结果造成显著影响，故对对照品长的微小变化可能对测定结果造成显著影响，故对对照品

3、和供试品测试条件应尽可能一致。和供试品测试条件应尽可能一致。若测定时不用对照品，则应在测定时对仪器作仔细的校正若测定时不用对照品，则应在测定时对仪器作仔细的校正和检定。和检定。中国药科大学中国药科大学中华人民共和国药典（中华人民共和国药典（2005年版）年版） 中华人民共和国药典（中华人民共和国药典（20052005年版）年版） 中国药科大学中国药科大学快速简便，仪器价格低廉；快速简便，仪器价格低廉；适合复杂体系不经分离的测定，可用于消除各种干适合复杂体系不经分离的测定，可用于消除各种干扰；扰；不宜用于定量分析的标准方法。不宜用于定量分析的标准方法。中国药科大学中国药科大学基本方法基本方法紫外

4、、可见吸收光谱中的吸收定律紫外、可见吸收光谱中的吸收定律clA212211AAlccA吸光度的加和性吸光度的加和性两类两类: 1. 消除共存组分消除共存组分 2. 并行计算方法并行计算方法 双波长等吸收点法双波长等吸收点法 双波长系数倍率法双波长系数倍率法三波长法三波长法导数分光光度法导数分光光度法 线性方程组、最小二乘法、线性方程组、最小二乘法、卡尔曼滤波法卡尔曼滤波法中国药科大学中国药科大学一、双波长计算分光光度法一、双波长计算分光光度法clAAA2121cA定量分析的依据定量分析的依据根据朗伯根据朗伯-比尔定律，待测溶液在不同的两个波长下比尔定律，待测溶液在不同的两个波长下，存在以下关系

5、：，存在以下关系：中国药科大学中国药科大学图图7-1 图解法选择波长组合图解法选择波长组合 常首选待测组分的最大吸常首选待测组分的最大吸收波长作为测定波长收波长作为测定波长1，因而，因而这里将苯酚的最大吸收波长这里将苯酚的最大吸收波长270nm选做选做1，在这一波长位置，在这一波长位置作一垂直于作一垂直于x轴的直线，交于共轴的直线，交于共存组分吸收曲线上的一点，在存组分吸收曲线上的一点，在从这一点，画一平行于从这一点，画一平行于x轴的直轴的直线，在共存组分的吸收曲线上线，在共存组分的吸收曲线上便有一个或几个交点，此交点便有一个或几个交点，此交点的波长作为参比波长的波长作为参比波长2。中国药科大

6、学中国药科大学图图7-2 一波长固定、一波长扫描法选择波长组合一波长固定、一波长扫描法选择波长组合中国药科大学中国药科大学P系数倍率法系数倍率法z二组份混合体系的测定二组份混合体系的测定21KAAA1212 2121KAAKAA,21KAA0AlcKAA21AA若给定一个比例常数K，使 ，则有其中若则消除了消除了 组份对组份对 组份的测定干扰组份的测定干扰K=1时，即为等吸收点法时，即为等吸收点法12AKA中国药科大学中国药科大学图图7-3 系数倍率法示意图系数倍率法示意图)K(21II)K(21III1中国药科大学中国药科大学21KAAA1、 越大越好越大越好波长对的选择原则波长对的选择原则

7、F系数倍率法系数倍率法2、测定波长，一般选择待测组份的最大吸收波长、测定波长，一般选择待测组份的最大吸收波长 处，且尽量避免在吸收曲线的陡坡处。处，且尽量避免在吸收曲线的陡坡处。3、K值不宜过大，一般以小于值不宜过大，一般以小于3为宜为宜 中国药科大学中国药科大学复方感冒胶囊中对乙酰氨基酚的含量测定复方感冒胶囊中对乙酰氨基酚的含量测定200300 nm范围内扫描 测定波长的选择测定波长的选择249nm262nm中国药科大学中国药科大学 K值的测定值的测定精密称取马来酸氯苯那敏适量， 用乙醇配成15，20，25 的溶液 在249nm和262nm处测定吸收度得K为1.350mLg21AA、12AA

8、K 中国药科大学中国药科大学 精密称取对乙酰氨基酸适量， 用乙醇制成浓度为5、6、7、8、9 的溶液在249nm和262nm处测定吸收度mLg21AA、得到浓度 与 的回归方程1A1c001.0065.011cA0000. 1平均回收率99.5%，RSD=0.5%工作曲线的绘制工作曲线的绘制211AKAA中国药科大学中国药科大学 三波长法三波长法 （1） 计算公式：计算公式： 利用三角形相似原理利用三角形相似原理nmmAnAAA312 （2） 调节调节m、n， 使组分使组分A足够大，足够大， 干扰干扰 A趋于趋于0中国药科大学中国药科大学根据相似三角形原理有根据相似三角形原理有因为因为则有则有

9、从图可知从图可知所以所以1321RMRNRQRMxAxMxA313123)()(213312332AMAA11MAA232113321)()(AAAA中国药科大学中国药科大学例例7-1 氨基氨基C酸偶氮氯膦酸偶氮氯膦(R)可与过渡元素可与过渡元素La、Sc分别形成络合物，它们的吸收光谱如图分别形成络合物，它们的吸收光谱如图7-5所示。试用三波长分光光度法消除所示。试用三波长分光光度法消除Sc的干的干扰。扰。解解 待测组分待测组分La的吸收曲线上选取吸光度差的吸收曲线上选取吸光度差较大的较大的B、C两点，对应于波长两点，对应于波长1（672.5nm）和和2(626.5nm)， 由此交于干扰组分由

10、此交于干扰组分Sc吸收吸收曲线的曲线的D和和E（本例中（本例中E和和B重合）。重合）。连结此两点，并外延交于第三点连结此两点，并外延交于第三点F，该点对，该点对应的波长即为应的波长即为3,由此通过作图得到由此通过作图得到3的初的初选值（选值（700nm）。）。 中国药科大学中国药科大学维生素维生素A及其制剂含量测定的三波长校正法及其制剂含量测定的三波长校正法本法由莫顿本法由莫顿斯塔布斯斯塔布斯(Morton Stubbs)提出提出,目前主目前主要用于维生素要用于维生素A及其制剂的测定及其制剂的测定,也有人将其用于某也有人将其用于某些激素类药物制剂的含量测定。些激素类药物制剂的含量测定。由于维生

11、素由于维生素A制剂中含有稀释用油和维生素制剂中含有稀释用油和维生素A原料原料药中混有其他杂质，所测得的吸光度不是维生素药中混有其他杂质，所测得的吸光度不是维生素A独有的吸收。独有的吸收。中国药典附录中国药典附录J规定了维生素规定了维生素A测定法使用三波长测定法使用三波长校正法校正非维生素校正法校正非维生素A物质的无关吸收所引入的误物质的无关吸收所引入的误差。差。中国药科大学中国药科大学 用校正公式计算；用校正公式计算； 应用三波长校正法需注意由于要在斜坡上测定吸应用三波长校正法需注意由于要在斜坡上测定吸光度，对仪器波长精度要求较高，应按规定对仪光度，对仪器波长精度要求较高，应按规定对仪器校正后

12、方可测定。器校正后方可测定。 国家药典委员会国家药典委员会. 中华人民共和国药典中华人民共和国药典. 北京北京:化化工出版社工出版社.附录附录46页页. 2005. 中国药科大学中国药科大学 7.3 导数光谱法导数光谱法仪器微分法（光学法，仪器微分法（光学法， 电子学法）电子学法）数值微分法数值微分法 （微机信号处理法）（微机信号处理法）一阶，一阶， 二阶，二阶， 四阶四阶消去干扰消去干扰提高分辨率提高分辨率中国药科大学中国药科大学零阶光谱的峰在奇数阶导数光谱中为零；而在偶数零阶光谱的峰在奇数阶导数光谱中为零；而在偶数阶导数光谱中是极值（极小和极大交替出现），阶导数光谱中是极值（极小和极大交替

13、出现）， 可用可用于对吸收曲线峰值的测定；零阶光谱的拐点在单数阶于对吸收曲线峰值的测定；零阶光谱的拐点在单数阶导数光谱中是极值；而在偶数阶导数光谱中为零，由导数光谱中是极值；而在偶数阶导数光谱中为零，由此可鉴别肩峰位置；此可鉴别肩峰位置；导数阶数增加，极值的数目也增加（极值数导数阶数增加，极值的数目也增加（极值数 = 导数导数阶数阶数1），原高斯谱为一个峰，经求四阶导数后，），原高斯谱为一个峰，经求四阶导数后，其峰谷数总和变为其峰谷数总和变为5，由此可导出，由此可导出n阶导数谱的峰谷数阶导数谱的峰谷数N=n+1。也就是说，原来在限定的波长区间内，仅容。也就是说，原来在限定的波长区间内，仅容纳一

14、个峰的原谱，经纳一个峰的原谱，经n阶求导转换后，变化成容纳阶求导转换后，变化成容纳n+1个峰和谷的图形，谱带变锐，这就是应用导数技术提个峰和谷的图形，谱带变锐，这就是应用导数技术提高分辨效应的依据。高分辨效应的依据。 中国药科大学中国药科大学对导数曲线的测量方法对导数曲线的测量方法（1）切线法切线法：对相邻两峰（谷）作切线，平行于纵轴测量：对相邻两峰（谷）作切线，平行于纵轴测量切线与谷（峰）之间的距离，如图的切线与谷（峰）之间的距离，如图的d，这种方法适用于，这种方法适用于具有线性背景的谱图。具有线性背景的谱图。（2）峰峰-谷法谷法：测量相领峰谷间的距离，见图中的：测量相领峰谷间的距离，见图中

15、的P1和和P2。此法多用于多组分分析中。此法多用于多组分分析中。（3）峰峰-零法零法：测量峰值到零线间的垂直距离，如图中的：测量峰值到零线间的垂直距离，如图中的Z，适用于对称于横轴的高阶导数曲线的测定。适用于对称于横轴的高阶导数曲线的测定。（4）面积法面积法：根据一阶或二阶导数曲线面积正比于有关物：根据一阶或二阶导数曲线面积正比于有关物质的浓度的关系，可进行定量分析。质的浓度的关系，可进行定量分析。中国药科大学中国药科大学定量依据：定量依据：定量方法：定量方法： 切线法：切线法：d 峰峰-谷法：谷法：P1、P2 峰峰-零法：零法：z 面积法：面积法： 面积和浓度的关系面积和浓度的关系 kcdA

16、nndkcdAnnd中国药科大学中国药科大学零阶光谱零阶光谱一阶导数一阶导数1、标准品、标准品2、样品、样品3、空白人工牛黄溶液、空白人工牛黄溶液例例1 导数光谱法测定人工牛黄中胆酸的含量导数光谱法测定人工牛黄中胆酸的含量中国药科大学中国药科大学从上述图谱中可以看出，在从上述图谱中可以看出，在310290nm范围内一范围内一阶导数光谱的最大全振幅值做为胆酸定量依据，阶导数光谱的最大全振幅值做为胆酸定量依据，可消除干扰。可消除干扰。线性范围测定线性范围测定 ：（略）（略）回归方程为：回归方程为：D=3.1294c+0.15 r=0.9999中国药科大学中国药科大学零阶吸收光谱零阶吸收光谱二阶导数

17、光谱二阶导数光谱a：酮基布洛芬：酮基布洛芬 b：空白基质：空白基质a：在：在255nm处的波长处的吸收谷；处的波长处的吸收谷； b：不干扰：不干扰例例2 二阶导数光谱法测定酮基布洛芬栓的含量二阶导数光谱法测定酮基布洛芬栓的含量中国药科大学中国药科大学第一类方法的缺点第一类方法的缺点1、仅适用于、仅适用于23组分组分2、一次测定一个组分、一次测定一个组分3、原理基于干扰组分光谱特征，、原理基于干扰组分光谱特征， 误差较大误差较大 第二类方法：第二类方法： 多个组分同时计算获得多个组分同时计算获得 1、最小二乘法及派生方法：、最小二乘法及派生方法： LS（最小二乘法），（最小二乘法）， PCA （

18、主成分分析法），（主成分分析法），PLS（偏最小二乘法），（偏最小二乘法），Kalman （卡尔曼滤波法）（卡尔曼滤波法） 2、 寻优方法：线性规划法（单纯形法），目标因子分析法寻优方法：线性规划法（单纯形法），目标因子分析法中国药科大学中国药科大学7.4 7.4 多元校正分光光度法多元校正分光光度法 7.4.1 多元线性回归法多元线性回归法 多元线性回归法（多元线性回归法（multiple linear regression, MLR）是建立在多元统计分析基础上的处理二维数据的是建立在多元统计分析基础上的处理二维数据的计算方法。计算方法。 1. 最小二乘法最小二乘法 2. 卡尔曼滤波分光光度

19、法卡尔曼滤波分光光度法中国药科大学中国药科大学7.4.2 因子分析法因子分析法4 因子分析（因子分析（factor analysis）是通过对数据矩阵进行特征分）是通过对数据矩阵进行特征分析、旋转变换等操作，以获取有关信息的数学方法。通过析、旋转变换等操作，以获取有关信息的数学方法。通过对数据进行解析，获得有影响的因子数目，可快速计算复对数据进行解析，获得有影响的因子数目，可快速计算复杂体系的大批量数据，进行定量分析、模式识别，还可用杂体系的大批量数据，进行定量分析、模式识别，还可用于数据压缩、分类及解释。于数据压缩、分类及解释。4 因子分析在化学中的应用十分广泛，大量用于处理复杂体因子分析在

20、化学中的应用十分广泛，大量用于处理复杂体系的色谱数据以及紫外、红外、质谱、核磁共振谱、系的色谱数据以及紫外、红外、质谱、核磁共振谱、X-射射线谱等各种光谱数据。线谱等各种光谱数据。 中国药科大学中国药科大学1、主成分分析法、主成分分析法2、主成分回归法、主成分回归法3、偏最小二乘法、偏最小二乘法4、目标转换因子分析、目标转换因子分析中国药科大学中国药科大学7.5 7.5 线性规划和非线性规划法线性规划和非线性规划法优化方法；优化方法；应用最小二乘法测定混合物浓度时有时会出现应用最小二乘法测定混合物浓度时有时会出现负解负解, 显然不合理。显然不合理。可考虑对研究体系设立约束条件，规定各组分可考虑对研究体系设立约束条件，规定各组分的浓度为正值，即的浓度为正值