组合型人工肝的研究进展

1、组合型人工肝的研究进展摘要：最近几年来以生物人工肝为主附加血或血浆灌流组成的体外的组合型人工肝辅助装置，成为研究最多的、最有希望的人工肝。本文就此型人工肝的意义，研究现状、存在的问题与前景作了综述。一、导言最近几年来，人工肝的研究有了专门大的进展。目前分为四型：（I）非生物型；（II）中间型；（HI）生物型；（IV）组合型1。研究最多的是组合型人I：肝装置（HybridartificialLiverDevice,HALD），亦称组合型人工肝支持系统（HybridArtificialLiverSupportSystem,HALSs）,是由HI型加I型或HI型加H型组成。这是因为过去40连年里，人

2、们前后尝试了血液透析、血液透析滤过、血或血浆灌流、血浆置换、活性炭灌注、交叉循环、互换输血及整体洗涤等多种形式的人工肝辅助装置，用这些方式尽管改善病人的神经状况，但不能改善其生率2。因此，人们熟悉到用肝细胞的生物肝才是较理想的人工肝。而生物肝尽管能较好地替代肝脏的解毒与生物合成功能，但急性肝衰竭患者体内积存的大量代谢产物及毒性物质，难以在有限的互换中由肝细胞来解毒，反过来还可能对培育肝细胞的存活及生物学功能产生不利阻碍，如将生物人工肝与偏重于解毒作用的人工肝结合起来,可令人工肝辅助装置的作用更完善。目前报导最多的是生物人工肝加上血或血浆灌流装置，后者内置活性碳或树脂等吸附剂3o二、组合型人工肝

3、的适应证意义就目前所知，肝脏至少有600多种酶。在医学领域里有很少情形比急性肝功能衰竭更具有破坏性，这是因为会细胞的坏死破坏了肝脏的合成，代谢、解毒和排泄功能与途径，致使高达80%的死亡率1,4K在以后人工肝有可能成为医治急性肝功能衰竭的要紧手腕之一，通过以下途径得以医治，并包括医治一些相关的疾病：（1）肝组织再生，若是肝脏以前的结构与功能是正常的，暴发性肝衰幸存者的肝组织能够完全再生，同时人工肝的肝细胞可分泌一些促再生的物质如肝细胞生长因子返回到病人肝脏中，增进肝细胞的再生，因这人工肝有可能维持肝衰病人存活，一直到肝细胞再生与功能恢复。（2）肝移植的桥梁：尽管肝移植术是目前医治肝功能衰竭的唯

4、一有效方法，但受严峻的器官欠缺所限制。一个理想的人工肝有可能通过支持肝功能来解决移植前的重在难题，直到有一个适合的供肝被移植。（3）医治肝移植后的最初无功能（PNF）o（4）提高再移植的存活率：若是人工肝能使肝的急症再移植手术变成择期手术的话，可提高再移植肝的存活率5。（5）有助于行肝叶吸量切除术，肝叶极量切除术后用人工肝支持其功能，使病人渡过危险期一直到肝组织再生。（6）人工肝可减少肝癌化疗的毒性作用。（7）有可能医治和预防慢性肝功能衰竭的失代偿。3、组合型人工肝研究的现况目前大多数组合型人工肝包括生物成份、生物反映器和血或血浆灌流三个部份3,6o生物成份为了替代肝脏的功能，曾试用了肝脏的切

5、片、细片、冻干粉沫、肝细胞酶等，但因其性能短且质量低，现很少应用。目前所用的多为动物或人的肝细胞。细胞来源动物肝细胞中猪肝细胞为首选。尽管分离后的肝细胞在体外很少增生，但来源是无穷的。尽管动物实验与临床有可喜的报告。但问题是动物肝细胞所合成的物质可否完全取代人的相应物质，而且异基因蛋白和酶进入到血循环中也能显现副作用4,7o用人的肝细胞似乎是理想的，但是体外分化的肝细胞很少增值，因此其来源成了问题。现经常使用的人肝细胞系是肝细胞瘤或肝胚细胞瘤，它们具有肿瘤的基因特点，尽管能表达一些特殊的酶且能合成一些蛋白和尿素，但这些细胞提供葡萄糖和代谢乳酸和合成尿素的能力是很低的，同时对这些细胞引发的危险和

6、副作用知甚少8。可行的事实是能够改变它们的基因型和表现型和形成亚克隆，而仍具有分化功能。另一种希望是以后弄清肝细胞增生和分化的机制，在此基础上通过基因工程在体外产生理想的稳固肝细胞系并贮存起来，当需要时用分化因子刺激;这种技术在其它高度分化的细胞中己经应用。用胎儿肝细胞在试管内增生并极可能被刺激而分化，这需要一些关于肝细胞分化的基础研究,也涉及到伦理问题。细胞培育在肝细胞单层培育中，尽管维持了几种重要的代谢功能。但细胞在24小时内失去了连接，在5天内失去特殊功能，于1-2周内死亡。以后由于熟悉到了肝细胞与肝细胞之间、肝细胞与基质间的彼此作用关于肝细胞维持分化功能与活性超级重要，使培育了的肝细胞

7、经长时刻的也能维持其功能2,10。这是肝细胞培育技术的一个重要冲破，因此使动物实验与临床有初步的成效。新改良的技术在培育基质中加有生长因子、激素和细胞外的基质成份和与肝非实质细胞一起培育。培育技术由最初的单层培育进展到不同的方式如多层平板型、胶原三明治状、球型聚集肝细胞、微囊肝细胞、微载体肝细胞培育、聚乙酰内酯培育等2,11。分离后的肝细胞需要固定在载体基质上如微载体、或多孔材料如树脂、或多孔微载体、微型海棉等，其它固定化技术包括将肝细胞置于水凝胶中。目前多用的是将细胞固定后粘附到中空细纤维壁外或腔内培育6o生物反映器生物反映器的设计要求:一个理想的生物反映器应包括以下大体内容：（1）细胞培育

8、技术：生物反映器不仅能知足细胞量的需求，而且应提供足够的膜面积以供肝细胞固定和培育。（2）膜的特性：应爱惜植入的肝细胞不被宿主排斥，阻止病人血中的抗体和免疫成份进入。现己证明膜截留物质的分子量在5-10万间能有效地阻止免疫成份。期待一种多孔的，海棉状的和相当亲水性的膜，以使细胞更易粘附和发挥更大的功能。（3）生物物应器的生物相容性：犹如血液透析器一样，膜的选择和内装的物质不该引发病人的生化和免疫反映。（4）膜的弥散：生物反映器应保证成功地去除血中的毒素并使肝的特殊因子返回到病人的血中12o生物反映器的类型目前应用最多的生物反映器仍为中空纤维，所用半透膜多是醋酸盐纤维素膜和纤维蛋白修饰的多聚碉膜

9、。依照培育形式分为两大类：一类是细胞培育在中空纤维或毛细管内腔，另一类是细胞培育在膜外腔。临床医治成效至少取决于三种因素，即细胞培育技术膜的特性和生物反映器的构型。常见的生物反映器构型包括：（1）细胞培育在中空纤维腔内凝胶床中：Nyberg等于1992年提出将原代肝细胞和胶原凝胶混合后植入中空纤维管内，当凝胶收缩时在腔内形成一通道，利用此管道来增加细胞的营养，血液或血浆通过膜外循环，并产生第二个层流以减少血膜的界面与浓缩界面之间的阻力，也减少血凝块的形成；缺点是流动液体中的浓度级差可使凝胶深部的细胞营养不足和代谢产物积存。（2）细胞培育在中空纤维膜外：1972年Gullin。等报告了分离的哺乳

10、细胞能够成功地培育在中空纤维壁外，这些管排列在一个壳内，即壳一管构形，血液于管腔内循环灌注，血液中的毒性物质可通过半透膜而代谢，肝细胞分泌的营养成份进入血中。优势是细胞容易且专门快地种植，细胞的植入量不受管内径的限制，因此细胞群和微载体附的肝细胞己培育在这型的生物反映器上，而且己商业化12。（3）细胞在毛细管膜编织的网间培育:这一生物反映器的概念于1993年由Gerlch等提出，其要紧组成是用毛细管编织成垫，形成三个平面，每一个平面呈90度角形成三维结构，三个平面别离运输氧、营养物质和血浆，肝细胞培育在管膜外，且可与细胞外基质或其它哺乳细胞一起培育13。己有报导，此种反映器的细胞密度可高达X1

11、09/ml,细胞的功能达到5周之久14。优势是运输的氧将供给血浆，同时随着浓度差也可营养肝细胞。一样，营养物质亦能供给血浆中相当数量的细胞而不依托于溶质的浓度。不同的膜垫组合，乃至在同一组中不同的膜垫，在不同的压力下能够促使通过细胞弥散对流来运输高分子量的溶质和迅速补给所消耗的溶质。溶质也随着单纯的弥散使其弥散能力极大地增强。但是这一现代化的装置至今没有取得临床应用，而且关于动物实验的成效知之甚少12o血或血浆灌流为了辅助生物肝的解毒功能，目前临床上试用的组合型人工肝多是用血浆分离后通度日性炭或树脂来吸附毒性物质再灌注到中空纤维中。血浆通过灌流去除中、大分子物质。活性炭在初期的研究中易显现肺梗

12、塞和出血偏向，以后显现了活性炭微囊和将此微囊固定在氨基甲酸乙脂膜上等形式，使其进展较快。树脂关于有毒物质的清除有专一性能，因此是有前途的吸附材料。4、组合型人工肝的动物实验与临床应用尽管组合型人工肝有不同的类型，但大体结构是相似的，即血或血浆进入到含有肝细胞的生物反映器中，再返回到病人血中，其循环上再加上一个辅助解毒的装置。第一个临床试用组合型人工肝的是Matsumur软，他于1987年报导了用血液透析装置内置兔的肝细胞，医治了一例没有手术的胆管癌患者，使其胆红素下降并使肝性脑病取得了改善。次年Uchino等报导了用组合型人工肝医治无肝犬，他用犬的肝细胞培育在胶原覆盖的硼盐玻璃器皿中，然后置入

13、丙烯酸的容器中，证明了合成尿素，糖原和白蛋白的功能达两周，并维持凝血酶原时刻、氨的代谢在正常水平，使无肝犬存活65小时15。而最近研究最多的是Rozga他于1994年报导了组合型人工肝的临床应用，1995年报导了用人工肝医治8例急性肝细胞衰竭患者，其中前3例用的是生物人工肝，后5例用的是组合型人工肝，皆取得了好的临床成效。1997年Watanabe与Rozga等报告了用组合型人工肝医治31例严峻肝衰的病人，所用的装置是将5X10/ml猪肝细胞粘附在胶原覆盖的葡萄糖微载体上，再接种到由醋酸纤维素制成的中空纤维壁外间隙；当病人血浆分离后先通过纤维素包裹的活性炭吸附，再灌注到中空纤维管内循环。另外在

14、装置中配有温度调剂和氧合装置以便为细胞提供生理环境。所有病人分为三组：第一组为暴了性肝功能衰竭患者，共18人，经医治后16例成功地用人工肝作为桥梁而行肝移植术，一例病情恢复后没有行肝移植，另一例死于伴发严峻的胰腺炎；第二组有3人,为肝移植后的最初无功能患者，皆成功地用人工肝作为桥梁而实行了肝的再移植术；第三组有10人，为慢性肝脏疾病的急性恶性化，医治后有2例病人肝功能恢复后成功地行肝移植术，其它8人虽用人工肝得以支持，但因不适合行肝移植而死亡。这是互到目前为止临床应用组合型人工肝最令人鼓舞的结果。五、组合型人工肝的问题与展望问题尽管组合型人工肝能够提供体外解毒、代谢、合成和调剂功能，但仍有以下

15、问题：（1）仍然不明白用何种来源的细胞为佳；（2）分离后的肝细胞如何才能维持分离前的高度分化形式和活性；（3）对异种肝细胞的排斥反映未完全解决；（4）由于人工肝需培育大量的肝细胞，而生物反映器未按比例地进展；（5）目前生物反映器的膜设计是为其它方面的用途，而不是专为知足肝功能辅助装置的需求12；（6）生物反映器的设计迄今为止不太注意流体力学、几何学和细胞量在生物反映器上散布；（7）对急性肝功能衰竭的病生理了解不够，如不了解某些因子的特性，很难推测限定这些因子运输的因素，也不可能制造出理想的膜17。展望尔后，理想的组合型人工肝是最有希望的人工肝辅助装置。以下几个方面需加以进展：（1）进展具有分化

16、功能的正常人类肝细胞系，有能力扩增胎干或成人肝细胞以诱导它们的分化功能，以利用于人工肝装置中，在这方面基因工程是有希望的；（2）在细胞培育中通过用新型的基质、生长因子和与其它类型的细胞一起培育，将肝细胞聚集成球形或细胞簇来增强肝细胞的分化功能19；（3）改良肝细胞的冷冻保留技术，以便容易运输这一装置；（4）新型的生物反映器应相当准确地按比例进展，并应注意流体力学；（5）生物反映器的膜设计应知足人工肝辅助装置的需求，且应有专一性；（6）增强对肝功能衰竭的病生理研究，以能设计出更合理的人工肝辅助装置；（7）进展灵敏的测定肝功能方式，并用严格的临床随机对照，以便更好地评判人工肝辅助装置20。总之，人

17、工肝辅助装置是一个综合性复杂的研究课题，需多学科的紧密合作。咱们相信以后的人工肝极有可能像人工肾曾给肾功能衰竭的医治带来革命性转变一样，为急性肝功能衰竭的现代化医治提供最大的希望。参考文献UchinoJ,Matsushitafortherescueofpatientswithliverfailure.ASAIOTaguchiK,MatsishitaM,TakahashiM,etal.Developmentofabioartificialliverwithsandwichedculturedhepatocytesbetweentwocollagengellayers.ArtificialOrga

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