丙酮酸发酵实验

1、丙酮酸发酵实验1.实验目的学习掌握利用发酵法生产丙酮酸的原理，掌握丙酮酸、残糖和菌体浓度的测定方法和工艺操作。2.实验原理丙酮酸是机体代谢的中间产物，既处于糖酵解（EMP）途径的末端，又是连接EMP途径和TCA循环的关键产物，它可经多条途径生成乙醇、乳酸、草酰乙酸、丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸等。因此其所处的位置极为特殊。根据代谢控制育种和发酵原理，要想在生物体内大量积累丙酮酸，就必须进一步切断或更确切地说是减弱丙酮酸的进一步代谢支路，加速丙酮酸的合成速度，去除代谢产物的反馈阻遏或反馈抑制（图1）。葡萄糖甘油NA异亮氨酸，缬氨酸磷酸烯醇式丙酮酸B1B1ADHNAPDC乙醇NA乙醛乳酸丙酮酸NALD

2、HAIDHPDC乙酸NAB1PdxACS乙酰辅酶A丙氨酸草酰乙酸Pdx谷氨酰胺-酮戊二酸谷氨酸加速代谢流切断或减弱圈内为辅酶或辅基（NA表示烟酸，B1为硫胺素，Bio为生物素，Pdx为吡哆醇。图1 丙酮酸的代谢途径及发酵机制3 实验仪器与材料5L自动控制发酵罐 TGL-16G台式高速离心机 752型紫外可见分光光度计500mL三角瓶 HZQ-Q恒温振荡器 手提式压力蒸汽灭菌器 LRH-250A型生化培养箱 SBA-40C型生物分析传感仪实验菌种：烟酸、硫氨酸、生物素和吡哆醇缺陷型的光滑球拟酵母（Torulopsis glabrata）种子培养基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨10，KH2PO4

3、1，MgSO47H2O 0.5，pH 5.6，自来水1L。发酵培养基(g/L)：葡萄糖 80g/L，蛋白胨 3g/L，硫酸铵5.9g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO47H2O 0.5g/L，烟酸8mg/L，盐酸硫胺素20g/L，生物素10g/L，盐酸吡哆醇 0.5mg/L，金属离子母液5mL/L，pH 5.6。金属离子母液：CaCL22 H2O，2g，FeSO47H2O，2g；ZnCL2，5g，MnCL4H2O，0.2g，CuSO45H2O，0.5g，2mol/L HCL溶解后定溶至1L。4 实验步骤与方法（1） 种子培养取新鲜斜面菌种1环，接入50 mL种子培养基（500mL锥形瓶）中

4、，30，200r/min振荡培养20小时。（2） 5L罐分批发酵实验空消：空罐灭菌。实消：将发酵培养基2.7L从进样口倒入5L发酵罐中，盖上盖子。检查发酵罐安装完好后，盖上灭菌罩，105灭菌15分钟。校正：校正pH电极、溶氧电极（校正方法参考5L罐使用说明书）接种与发酵：在接种圈的火焰保护下，将种子培养液300mL倒入发酵罐中，控制发酵温度30，pH为6.0, 溶氧:0-12h通风60L/h，发酵罐搅拌 100r/min，12-72h停止通风和搅拌。自动流加8mol/L NaOH溶液控制发酵液pH为5.00.05，发酵过程产生的泡沫较多时，手动加入已灭菌的泡敌2-3滴即可迅速消泡，当残糖浓度低

5、于5g/L时发酵结束。测量：每隔4h取样，测菌体浓度、葡萄糖和丙酮酸浓度。在火焰下，按10%(v/v)接种量将种子接入发酵罐中，装液量3L，通风量1 L/(Lmin)，发酵温度30，通过调节搅拌转速控制溶氧(DO)：1-12h控制溶氧值为80100%，12 控制溶氧值为70-80%。自动流加8mol/L NaOH溶液控制发酵液pH为5.00.05，发酵过程产生的泡沫较多时，手动加入已灭菌的泡敌2-3滴即可迅速消泡，当残糖浓度低于5g/L时发酵结束。（3）分析方法菌体干重的测定将含有4mL发酵液的塑料离心管置于台式离心机中，于10000 r/min下离心5min,放于电热鼓风干燥箱80 烘干至衡

6、重，计算出细胞干重。上清液用于测定残糖浓度、丙酮酸浓度。 葡萄糖的测定用SBA-40C型生物传感仪检测。将离心后的上清夜稀释适当的倍数(100倍)，用进样器吸取25L进样。 丙酮酸的测定取10mL丙酮酸发酵液，离心（4000r/min,10mL）除去菌体，取5mL离心后的上清液至于500mL容量瓶中，再加入5mL 0.01mol/L的硫酸溶液进行酸解，使有机酸游离出来，然后定容并取适量以0.45m孔径的滤膜过滤即得到待测样液。采用反相色谱柱ODS-2 HYPERSIL(250mm4.6mm，5m)，以0.05mol/L NH4H2PO4 （用H3PO4调pH2.6）作为流动相，在流速1mL/m

7、in，波长215nm下测定。5实验数据处理发酵培养时，按照一定的时间间隔取样测定并记录，结果如下表。时间h葡萄糖浓度/(g/L)菌体干重/(g/L)丙酮酸浓度/(g/L)048121620242832364044486 结果与讨论（1）按照上表给出的相应数据，以时间为横坐标，表中数据为纵坐标绘图，分析各量的变化规律。（2）糖酸转化率(%)：生成丙酮酸的克数与消耗葡萄糖克数之比的百分数。7. 参考文献 （1）高年发 张现青 溶氧对发酵丙酮酸的影响J天津. 天津科技大学学报vol9.No.3. 2004. （2）楼良旺 高年发 紫外分光光度法测定丙酮酸J北京：分析实验室.vol24.No.4.2005. （3）高年发 吴迪 张健 反相高压液相色谱法测定丙酮酸发酵液中丙酮酸J天津.天津科技大学学报。Vo21.No.1. 2006. （4）占桂荣 高年发不利用丙酮酸的丙酮酸生产菌的选育J生物加工过程.Vo4.No.4. 2006.8. 预习与思考 请预习