肿瘤细胞的甲硫氨酸依赖性对提高肿瘤化疗疗效的作用

1、    肿瘤细胞的甲硫氨酸依赖性对提高肿瘤化疗疗效的作用         摘要目的探讨肿瘤细胞的甲硫氨酸依赖性在提高肿瘤化疗疗效方面的作用及意义。方法将甲硫氨酸(Met)依赖性肿瘤细胞SGC-7901、MCF-7和非Met依赖性肿瘤细胞A549、A375培养于Met- Hcy+和Met+Hcy-培养基中，加入不同浓度的周期特异性化疗药5-Fu或非周期特异性化疗药MMC；在细胞与药物接触不同时间段，用MTT比色法检测化疗药物的抑瘤率。结果Met- Hcy+中的5-Fu对Met依

2、赖性肿瘤细胞的抑瘤率较Met+ Hcy-中的5-Fu的抑瘤率有显著性提高；而5-Fu对非Met依赖性肿瘤细胞的抑瘤率，在两种培养基间差异无显著性。MMC对Met依赖性、非Met依赖性肿瘤细胞的抑瘤率未因培养基的不同而差异有显著性。结论利用肿瘤细胞的Met依赖性，Met- Hcy+培养基可显著提高周期特异性化疗药(5-Fu)对Met依赖性肿瘤细胞的抑瘤率，但不能提高周期非特异性化疗药(MMC)的抑瘤率。关键词甲硫氨酸肿瘤细胞周期特异性化疗The implication of tumor cells' methionine dependence in chemotherapyCAO Wei

3、xin, XU Ning, YIN Haoran, et al.Rui Jin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025Abstract Objective To study the implication of tumor cells' methionine (Met) dependence in promoting the effects of chemotherapy.Methods Met-dependent tumor cells (SGC-7901 and MCF-7) and Met-ind

4、ependent tumor cells (A549 and A375) were cultured in Met- Hcy+ and Met+ Hcy- media separately, then cell-cycle specific chemotherapeutic agent (5-Fu) and cell-cycle nonspecific chemotherapeutic agent (MMC) in different concentration gradients were added. The inhibitory rate of tumor cells were test

5、ed by MTT assay after different contacting time between the cells and the agents. Results The combination of 5-Fu with Met- Hcy+ medium made a significantly higher inhibitory rate to Met-dependent tumor cells than the combination of Met+ Hcy- medium with 5-Fu. However, to Met-independent tumor cells

6、, there was no significant difference of inhibitory rate that 5-Fu could make, whether it was combined with Met- Hcy+ or Met+ Hcy- medium. As a cell-cycle nonspecific chemotherapeutic agent, MMC did not make significantly different in inbibitory rate between Met- Hcy+ medium and Met+ Hcy- medium, wh

7、ether to Met-dependent tumor cells or Met-nondependent tumor cells.Conclusion In the light of Met-dependence of tumor cells, Met- Hcy+ medium can significantly increase the inhibitory rate of cell-cycle specific chemotherapeutical agent to Met-dependent tumor cells, but cannot do it when the drug is

8、 cell-cycle nonspecific chemotherapeutical agent.Key words Methionine Tumor cell Cell-cycle specific chemotherapy Cell-cycle nonspecific chemotherapy我们利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)快速比色法，探讨肿瘤细胞在体外培养中的甲硫氨酸(Met)依赖性在肿瘤化疗中的意义，现将结果报道如下。材料与方法1.细胞培养(1)细胞株：实验对象选择已知具有Met依赖性的MCF-7乳腺腺癌细胞和SGC-7901细胞(人胃腺癌，1979年上海市第六人民医院建株)，以及非M

9、et依赖性的A569(肺癌)和A375(恶性黑色素瘤)细胞(均购自中国科学院上海细胞研究所细胞库)。(2)培养条件2：以不含Met的RPMI-1640培养液(GIBCO公司)为基础，按表1配制成含Hcy、不含Met的Met- Hcy+培养基和含Met、不含Hcy的Met+ Hcy-培养基。各组细胞均培养于37，含体积分数为5%CO2和体积分数为95%空气的细胞培养箱(NAPC05410，美国)中。表1Met- Hcy+培养基和Met+ Hcy-培养基的补充成分培养基MetHcy叶酸VitB12庆大霉素小牛血清Met- Hcy+-200mol/L100mol/L1.5mol/L0.2g/L20%

10、Met+ Hcy-100mol/L-100mol/L1.5mol/L0.2g/L20%     2.配制化疗药物溶液分别以Met- Hcy+培养基和Met+ Hcy-培养基为基础配制不同浓度梯度的5-氟脲嘧啶(5-Fu)和丝裂霉素(MMC)药物溶液。其中，5-Fu溶液的浓度梯度为0、2、20、40、100、200mg/L，MMC溶液的浓度梯度分别为0、0.6、6、60mg/L，均为与细胞接触的终浓度的2倍。3.MTT测试1，2(1)各组细胞分别以Met- Hcy+和Met+ Hcy-为培养基制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×105/ml。(2)

11、接种：将每种单细胞悬液接种于96孔板中，100l/孔。5-Fu组设0、1、10、20、50、100mg/L共6个浓度组，MMC组设0、0.3、3、30mg/L共4个浓度组，每组设4个复孔，0浓度组为空白对照组。(3)加药：细胞培养24小时后，加入各浓度梯度5-Fu或MMC药物溶液，每孔100l，使每孔总液量达到200l。与肿瘤细胞接触的5-Fu终浓度分别为0、1、10、20、50、100mg/L(10mg/L为体内血峰浓度)；MMC终浓度分别为0、0.3、3、30mg/L(3mg/L为体内血峰浓度)。(4)继续培养24小时和48小时后，每孔加5mg/L的MTT20l；4小时后，以1500r/m

12、in离心5分钟，弃上清液，每孔加二甲基亚砜(DMSO)200l，振荡，吹打，充分溶解孔底的结晶物。(5)自动酶标仪比色，波长为490nm，得到每孔的光密度值(OD)，每组取4孔的平均OD值。(6)计算化疗药物的抑瘤率：    4.统计学方法方差分析。结果1.5-Fu的抑瘤率与Met+ Hcy-培养基组相比，Met- Hcy+培养基组中的MCF-7、SGC-7901细胞(Met依赖)与5-Fu接触24小时，抑瘤率差异无显著性(P0.05)；而接触48小时后，抑瘤率有显著提高。非Met依赖的肿瘤细胞(A549、A375)经两种培养基培养后，无论与5-Fu接触

13、24小时还是48小时，抑瘤率均无显著改变。各组细胞的抑瘤率均随5-Fu浓度的升高而增加。2.MMC的抑瘤率MMC对Met依赖性肿瘤细胞(MCF-7，SGC-7901)或非Met依赖性肿瘤细胞(AM-Hcy+培养基和Met+ Hcy-培养基)或细胞与药物接触时间的长短(24小时或48小时)而差异有显著性(P0.05)。但MMC对各组细胞的抑瘤率均随着药物浓度的升高而增加。讨论本研究结果显示，两种不同培养基加5-Fu溶液的抗肿瘤作用有明显差异，提示Met- Hcy+培养基具有化疗药物增效剂的作用，但如果5-Fu与细胞接触时间缩短为24小时，则两种不同培养基加5-Fu的抑瘤作用差异无显著性。推测其原因，可能系实验开始阶段，培养基中的小牛血清含有少量Met，随着培养时间的延长，外源性Met逐渐耗尽，肿瘤细胞对Met的依赖性逐渐显露。在加入MMC的实验中，尽管在3mg/L的血峰浓度，MMC对肿瘤细胞有较高的抑制率，然而，无论是Met依赖性还是非Met依赖性肿瘤细胞，MMC的抑瘤率还是非Met依赖性肿瘤细胞，MMC的抑瘤率并未因不同培养基而产生显著差异；并且，也未因MMC与细胞的接触时间不同而呈现