鼠伤寒沙门氏菌、哺乳动物肝微粒体致突变性实验

1、毒理学基础实验课毒理学基础实验课鼠伤寒沙门氏菌微粒体酶试验鼠伤寒沙门氏菌微粒体酶试验Ames test毒理学基础实验课毒理学基础实验课原原 理理鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌野生型（原养型）野生型（原养型）人工方法正向诱变鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型（异养型）组氨酸缺陷型（异养型）诱变物作用回复突变 AmesAmes是检测遗传毒理学的体是检测遗传毒理学的体外试验，检测终点是基因突变外试验，检测终点是基因突变通过统计回复突变的菌落数通过统计回复突变的菌落数判断受试物质的致突变性高低判断受试物质的致突变性高低毒理学基础实验课毒理学基础实验课S-9S-9混合液的制备过程混合液的制备过程（使

2、需要代谢激活的物质得以活（使需要代谢激活的物质得以活化）化）暴露肝脏，暴露肝脏，KCLKCL灌注灌注断头处死大鼠、放血、去皮断头处死大鼠、放血、去皮取出肝脏，加入取出肝脏，加入KCLKCL剪碎剪碎制成匀浆，制成匀浆，9000g9000g离心离心取上清、分装、冻存取上清、分装、冻存毒理学基础实验课毒理学基础实验课1 实验用菌液制备实验用菌液制备 平板菌落计数法平板菌落计数法，是种统计物品含菌数的有效方法。方法如下：将，是种统计物品含菌数的有效方法。方法如下：将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布

3、到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。数。2 菌株性状鉴定菌株性状鉴定 （1）组氨酸营养缺陷型）组氨酸营养缺陷型 （2）深粗糙突变测定）深粗糙突变测定 （3）R因子的鉴定因子的鉴定 （4） 切除修复缺失鉴定切除修复缺失鉴定 （5）自发回变量测定）自发回变量测定 （6）回变特性鉴定）回变特性鉴

4、定实验步骤与方法实验步骤与方法毒理学基础实验课毒理学基础实验课深粗糙深粗糙（rfa）特性特性2紫外线敏感（紫外线敏感（UvrB）特性）特性3抗氨苄青霉素（抗氨苄青霉素（R因子）特性因子）特性4回变特性鉴定回变特性鉴定6组氨酸需求特性组氨酸需求特性1自发回变特性自发回变特性5毒理学基础实验课毒理学基础实验课1、组氨酸需求特性、组氨酸需求特性有细菌生长有细菌生长空白空白空白空白组氨酸组氨酸- -生物素生物素赖氨酸赖氨酸空白空白37 24h0.1ml0.1ml菌液菌液顶层顶层底层底层毒理学基础实验课毒理学基础实验课2、深粗糙（、深粗糙（rfa）特性）特性0.1ml0.1ml菌液菌液顶层顶层普通培养基

5、普通培养基抑菌环抑菌环滤纸片（有结晶紫）滤纸片（有结晶紫）3724h24h毒理学基础实验课毒理学基础实验课3、紫外线敏感特性、紫外线敏感特性普通培养基普通培养基15W紫外灯紫外灯33cm，8s37，24h毒理学基础实验课毒理学基础实验课4、抗氨卞青霉素（抗氨卞青霉素（R R因子）因子）特性特性37，24h青霉素青霉素普通培养基普通培养基毒理学基础实验课毒理学基础实验课5、自然回变特性、自然回变特性0.1ml0.1ml菌液菌液顶层顶层底层底层37，24h毒理学基础实验课毒理学基础实验课菌株菌株基因型基因型组氨组氨酸缺酸缺陷陷脂多糖脂多糖屏蔽缺屏蔽缺失失抗氨抗氨卞西卞西林林抗四抗四环素环素uvrB

6、uvrB修修复缺复缺陷陷自发回变自发回变（-S9-S9）TA97TA97+ + + +- -+ +90-18090-180TA98TA98+ + + +- -+ +30-5030-50TA100TA100+ + + +- -+ +120-200120-200TA102TA102+ + + +- -+ +240-320240-320毒理学基础实验课毒理学基础实验课6、回变特性鉴定、回变特性鉴定0.1ml0.1ml菌液菌液0.1ml0.1ml致突变物致突变物0.2-0.5mlS-90.2-0.5mlS-9顶层顶层底层底层37，24h毒理学基础实验课毒理学基础实验课实验设计原则实验设计原则受试物最低

7、剂量为每皿受试物最低剂量为每皿0.1g0.1g一般选用一般选用4545个剂量个剂量 每个剂量应做每个剂量应做2 2或或3 3个平行平皿个平行平皿 设立阳性对照和阴性（溶剂）对照设立阳性对照和阴性（溶剂）对照 受试物最高剂量为每皿受试物最高剂量为每皿5mg5mgAmesAmes试验设计试验设计毒理学基础实验课毒理学基础实验课将顶层培养基倒入底层培养基中，凝将顶层培养基倒入底层培养基中，凝固后放入滤纸片，将受试物点在纸片固后放入滤纸片，将受试物点在纸片上放入底层，上放入底层，3737培养培养48h48h观察结果观察结果将受试物将受试物0.1ml0.1ml、菌液、菌液0.1ml0.1ml分别加入分别

8、加入顶层培养基中，倒入底层培养基中，顶层培养基中，倒入底层培养基中，凝固后凝固后3737培养培养48h48h观察结果观察结果AmesAmes试验方法及结果评价试验方法及结果评价点样纸片周围长出一点样纸片周围长出一圈密集的圈密集的His+His+回变菌回变菌落者，受试物即为阳落者，受试物即为阳性致突变物质。性致突变物质。背景菌生长良好受试物背景菌生长良好受试物每皿回变菌落数增加一每皿回变菌落数增加一倍以上并有剂量倍以上并有剂量- -反应反应关系，试验结果具有重关系，试验结果具有重现性即可认为该受试物现性即可认为该受试物为诱变阳性。为诱变阳性。 毒理学基础实验课毒理学基础实验课结果与报告结果与报告1 实验结果判断与评价（1）点试法 凡在点样纸片周围长出一圈密集的his回变菌落者，该物质具有致突变性，即为阳性；如只出现少数散在菌落，则为阴性。（2） 掺入法 突变率=诱发回变his菌落数