四环素的发酵参数及生产工艺研究

1、 科研训练论文(文献综述)（题 目：四环素的发酵参数及生产工艺争辩同学姓名：学 号：学 院：化工学院班 级：班2016 年 1月四环素的发酵参数及工艺争辩 姓名： 指导老师：内蒙古工业高校化工学院，呼和浩特，010051 摘要：四环素(Tetracycline),是一种对抗立克次体、多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌等病原体的“广谱”抗生素，另外，四环素也是一种重要的饲料添加剤，拥有宽敞的市场前。四环素的工业生产通常接受发酵法，该方法以金色链霉菌为发酵菌株，从而生产合成四环素。随着工业的快速进展传统方法合成四环素已经不足以满足工业化生产，而本文通过把握发酵中的发酵参数，从而让其发酵过程朝着产率高的

2、方向进行。同时也供应了向培育基中加溴化钠水溶液和四环素通氨补料方法的发酵工艺。关键词：四环素；金色链霉菌；发酵参数；发酵工艺引言 在发酵工艺过程中搅拌速度、通气量、发酵液的粘度、温度、发酵液pH、发酵罐的压力、搅拌速度等因素，都会不同程度的影响四环素的产率，因此在生产工艺过程中对发酵参数的把握，将会朝着产率高的方向进行。不同的发酵工艺方法也会有不同的产率，好的发酵方法不仅生产工艺途径短，还能经济实惠。一、发酵参数利用发酵法生产合成四环素主要把握参数一般分为物理参数、化学参数、生物参数三类。（一）物理参数1、温度：微生物发酵所用的菌体绝大多数是中温菌，如霉菌、放线菌和一般细菌。它们的最适生长温度

3、一般在2040。在发酵过程中，需要维持适当的温度，才能使菌体生长和代谢产物的合成顺当进行.如四环素生产菌在30时合成金霉素，35时，只产生四环素，合成方向会转变,利用自动把握或手动调整的阀门，将冷却水通入发酵罐的夹层或蛇行管中，通过热交换来降温，保持恒温发酵1。2、压力：发酵罐压一般为 0.02-0.05Mpa2 3、搅拌转速:随着发酵过程的进行，发酵液中菌株浓度不断増大，发酵液粘度也随之不断上升，从而导致传质系数KLa下降，进而导致溶氧量下降，而溶氧量的过度降低会对菌株的生长代谢产生不利影响。为避开上述情況，向发酵培育基中添加溴化钠水溶液，协作肯定的搅拌速度，能够削减由于菌株浓度增大产生的泡

4、沫和滞留液膜，降低发酵培育基的粘度，从而提高其流变特性、KLa和溶氧水平，进而有利于菌株的发酵。搅拌转速200-900r/Min为宜3。4、通气量：加大通气流量不仅会増加发酵液的蒸发损失，还会带走一些挥发性的代谢中产物，从而导致能耗增加、产率降低。适宜的通气量尤为重要，本创造的工艺参数通气比为1:0.525。5、浊度：反映单细胞生长状况的参数。如大肠杆菌，用光密度650nm上检测或计数板计数。6、料液流量（L/min）:这是把握流体进料的参数。（二）化学参数1、PH ：四环素为两性化合物，等电点为PH5.4,此时以游离形式存在，PH4-7.2范围内难溶于水，低于pH4的酸或高于PH8的碱性溶液

5、中，溶解度很高。首先考虑和试验发酵培育基的基础配方，使它们有个适当的配比，使发酵过程中的pH值变化在合适的范围内,而四环素合成适宜PH为5.8-6.02。2、溶解氧浓度 随着发酵过程的进行，发酵液中菌株浓度不断増大，导致溶氧量下降，而溶氧量的过度降低会对菌株的生长代谢产生不利影响，而向发酵液加入溴化钠水溶液，提高培育基的流变特性和溶氧水平10。3、溶解CO2浓度 四环素生物合成的适宜CO2浓度为2%-8%，浓度超过15%将抑制菌体生长2。（三）生物参数1、菌丝形态：观看菌丝形态是生产中最常用的方法。每隔8小时镜检，能准时发觉特别染菌。四环素生产，生产菌生长分为I.孢子发芽，II.次生菌丝增殖，

6、III.产物分泌，消灭空胞，IV.菌丝自溶，菌丝形态模糊4。2、菌体浓度：对初级产品来说，菌浓愈大，产量愈高，但菌浓符合生长曲线。次级产品如菌浓过大，由于代谢产物的积累，会影响产量。因其产品与原料并非对应（或底物抑制，分介产物抑制等）7。2、 四环素的发酵工艺争辩 四环素的工业生产通常接受发酵法，该方法以金色链霉菌为发酵菌株。发酵过程中，发酵液的溶氧量对金色链霉菌菌株的生长代谢有很大的影响。而该溶氧量与发酵液的传质系数(KLa)成正比9。影响KLa的主要因素包括搅拌速度、通气量、发酵液的粘度、发酵液的表面张力、发酵液的离子强度等。随着发酵过程的进行，发酵液中菌株浓度不断増大，发酵液粘度也随之不

7、断上升，从而导致KLa下降，进而导致溶氧量下降，而溶氧量的过度降低会对菌株的生长代谢产生不利影响5。目前大多接受以下方法提高发酵液的KLa ；1)加大搅拌速度；2)加大通气流量；3)添加水分。上述方法虽然在肯定程度上缓解了KLa的下降趋势，然而这些方法存在诸多不尽如人意的地方，例如加大搅拌速度会对菌株造成不同程度的损伤，这是由于金色链霉菌对剪切力格外敏感；而加大通气流量不仅会増加发酵液的蒸发损失，还会带走一些挥发性的代谢中产物，从而导致能耗增加、产率降低；添加水分虽然能降低发酵液的粘度，但会导致发酵液的滲透压快速降低，从而干扰菌株正常的生长代谢。（一）向发酵培育基加入溴化钠水溶液法 在发酵过程

8、中，向发酵培育基中添加溴化钠水溶液。接受这一方法，通过向发酵培育基中添加溴化钠水溶液，一方面，能够削减由于菌株浓度增大产生的泡沫和滞留液膜，降低发酵培育基的粘度，从而提高其流变特性、KLa和溶氧水平，进而有利于菌株的发酵；另一方面，添加溴化钠水溶液，还能增加发酵培育基中的电解质浓度，进步降低泡沫的产生，同时能够使发酵培育基维持适宜菌株生长的滲透压。1、生产菌种 本课题接受四环素生产菌，即金色链霉菌，通过在培育基加入抑氯剂和氯的竞争剂时，能合成高产量的四环素。其在固体培育基上分泌金黄色色素，气生菌丝无色素。孢子在气生菌丝上排列成链状、圆形或椭圆形。初期是白色，后期变灰黑色，发酵中用亚甲蓝染色，看

9、菌丝状态6。变化特征为第一期：原生菌丝期，孢子发酵，成菌丝团其次期：次生菌丝期，菌丝团散开，生成大量次生菌丝第三期：产物分泌期，菌丝变短，消灭空胞第四期：菌丝自溶期，菌丝模糊，自溶降解2。2、 斜面培育 取金色链霉菌（Aareys)菌株在无菌条件下接种于预先制备好的固体斜面培育基上，在35°C下恒温培育5天15。上述固体斜面培育基是依据常规方法制备的，其配方为3.2G/L麸皮，2.5G/L琼月旨，0.16G/L磷酸铵，0.1G/L磷酸氢钾，0.05G/L硫酸镁3。3、种子制备 种子培育将斜面培育后的菌株在无菌条件下接种到预先制备好的种子培育基中，在33°C、300 R/Mi

10、n的条件下培育22-25H，得到种子液14。上述种子培育基是依据常规方法制备的，其配方为3.4 G/L葡萄糖，2.9 G/L黄豆饼粉，0.6 G/L玉米浆，0.5G/L硫酸铵，0.01G/L磷酸氢钾，0.02 G/L硫酸镁，0.15 G/L溴化钠，0.4G/L碳酸钙，0.6G/L酵母粉13。4、发酵培育 发酵培育将种子制备步骤所得种液在无菌条件下接种到预先制备好的发酵培育基中，在30°C，搅拌转速200r/Min的条件下进行发酵，发酵过程的通气比为1:0.5212。发酵开头后60h，向发酵培育基中添加溴化钠水溶液。所述溴化钠水溶液,其体积为发酵培育基体积的2%，其中溴化钠的浓度为0.

11、 005g/L和加入微量硫氢化苄（0.0001%-0.0002%）。发酵开头后180h，停止发酵，測定所得发酵液中四环素的效价，结果为30000U/mL。上述发酵培育基是依据常规方法制备的，其配方为8 G/L淀粉，2.5G/L黄豆饼粉，2g/L玉米浆，5G/L硫酸铵，0.015 G/L磷酸氢钾，0.008G/L硫酸锰，0.15G/L溴化钠，0.002G/L M-促进剂，0.6 G/L碳酸钙，0.008 G/L淀粉酶3。得出的结论是比传统工艺生产的效价高。5、此方法的进展前景 简便易行的方式增大发酵培育基的KLa值，效果良好。试验表明，接受所述方法，四环素的产率提高16%以上3。通过与传统方法相

12、比，过程与方法相差无几，但是大大提高了四环素的产率，进展前景宽敞。（二）四环素通氨补料法四环素通氨补料是四环素发酵工艺的一种新方法。四环素发酵原工艺的缺点是点是发酵单位低。通氨补料是用通氨的方法制造菌种生长适应的 p H 值,强化菌种代谢，补充养分,以达到提高发酵单位的的。东北制药总厂 、沈阳市其次制药厂都接受了通氨补料工艺,取得了显著效果。四环素产品的发酵单位、收率、全耗、主耗等各项技术经济指标,都刷新了历史最好水平。东北制药总厂在学习华北药厂先进经 验的基础上,结合该厂在原料、设备、空气动力等方面的实际条件， 选 择了通氨补料菌种、培育基配方和工艺把握条件,经半年多的生产试 验证明,它有如

13、下几个优点:1、平均发酵单位由18208)/ml提高到215497/ml;2、总收率提高18.6%;3、罐批产量提高94公斤;4、主要原材料总耗下降6.6公斤/十亿 ;5、年节省化工原料250吨,年节省价值26万元8。结论 通过对本课题的争辩探讨以及对相关文件的查找与整理，在发酵法合成四环素的工艺过程中，向发酵培育液加入溴化钠水溶液，一方面，能够削减由于菌株浓度增大产生的泡沫和滞留液膜，降低发酵培育基的粘度，从而提高其流变特性、KLa和溶氧水平，进而有利于菌株的发酵；另一方面，添加溴化钠水溶液，还能增加发酵培育基中的电解质浓度，进步降低泡沫的产生，同时能够使发酵培育基维持适宜菌株生长的滲透压。

14、而培育基一和传统工艺四环素效价对比中，能得出，此方法能够增大发酵培育基的KLa值，效果明显提高了四环素的产率。 四环素通氨补料法，从上所述，经济方面经济实惠，原材料的利用率得到提高。效益方面，产率提高，效率提升。参考文献1邢杰, 汤长林.锥形发酵罐(C.C.T)发酵温度把握与发酵质量的几点生疏.生物科技.2005，12：2-5.2 元英进.制药工艺学.北京.化学工业出版社.20073张宝荣, 吴飞, 魏伟.一种发酵生产四环素的方法.生物技术.2012,14,33-344王清海.链霉菌R15作用机制及-葡萄糖苷酶的纯化与特性争辩.山东高校.20065B.V.R.Bornot.al.Handboo

15、k imental Pharmaeology,1955,vol.78,137-1786蒋增良.自然微生物酵素发酵机理、代谢过程及生物活性争辩.应用化学，2013,42-43.7左勇.金霉素摇瓶发酵把握条件的优化 .四川理工学院学报(自然科学版).2012.8周毅，李栋.四环素通氨补料工艺.济南高校.2008.9Zhi-Fa Lv.Meta-analysis:Is combination of tetracycline and amoxicillin suitable for Helicobacter pylori infection .World Journal of Gastroenterology.2015.10Bing Li.Characterization of tetracycline resistant bacteria in saline activated sludge using next-generation sequencing analysis .Proceedings of the International Workshop on the Environmental Dimension of Antibiotic Resistance .2013