假型逆转录病毒载体高效介导兔平滑肌细胞基因转染

1、假型逆转录病毒载体高效介导兔平滑肌细胞基因转染         11-01-07 09:59:00     编辑：studa20                   作者：裴斐，何蕊，李俊彦，余红【摘要】  目的 构建假型逆转录病毒载体MuLV/VSVG，并用于转染兔平滑肌细胞，为兔平滑肌

2、细胞基因转染寻找一种高效的载体。方法 构建含有报道基因lacZ的假型逆转录病毒载体MuLV/VSVG，测定滴度，并转染兔平滑肌细胞，观察其转导效率。并与MuLV的转导效率进行比较。结果 构建的MuLV/VSVG载体，病毒滴度为67.8×106CFU，转染兔平滑肌细胞的效率是(92±12)%。而MuLV的转导效率为(24±5)%。结论 成功构建了假型逆转录病毒载体MuLV/VSVG载体，该载体作为一种高效的载体可用于兔平滑肌细胞基因转染。 【关键词】  假型逆转录病毒载体；平滑肌细胞；转染ABSTRACT: Objective  To const

3、ruct pseudotyped retroviral vector MuLV/VSVG and transfer it into rabbit smooth muscle cells (SMC) in order to provide a highefficiency vector for SMC gene transfer. Methods  We constructed pseudotyped retroviral vector MuLV/VSVG containing the previously reported gene lacZ, determined the tite

4、r, and determined the efficiency of gene transfer into SMC mediated by pseudotyped retroviral vector MuLV/VSVG. Finally the transfer efficiency was compared with that by MuLV. Results  MuLV/VSVG vector was constructed. The titer of the vector was 6-7.8×106CFU, the transfer efficiency was (

5、92±12)% by using MuLV/VSVG vector and (24±5)% by MuLV vector. Conclusion  Pseudotyped retroviral vector MuLV/VSVG which was constructed successfully is a kind of highefficiency gene transfer vector in smooth muscle cells.KEY WORDS: pseudotyped retroviral vector; smooth muscle cell; ge

6、ne transfer基因治疗是指将具有防治潜能的外源基因，通过相应的载体转移到患者的有关组织器官和细胞内，获得适当的表达达到防治和减轻疾病的目的。其中目的基因载体的选择是基因治疗的关键之一。逆转录病毒是较常用的一种病毒载体。鼠白血病病毒MuLV衍生的逆转录病毒载体被广泛应用于将基因转染到哺乳细胞中并长期表达1。但该载体稳定性差，产生的病毒滴度低，转染到人类细胞效率低，并且只能转染分裂期细胞。VSVG，疱疹性口炎蛋白VSV的包膜蛋白，是一种单链蛋白，可以完全替代MuLV的env蛋白，产生基于MuLV的高转染率的病毒载体MuLV/VSVG，已经被用来构建假型MuLV/VSVG以提高MuLV载体的

7、稳定性及转染效率2。本研究用兔平滑肌细胞作为靶细胞，观察MuLV/VSVG的转导效率，并与MuLV的转导效率进行比较，探讨MuLV/VSVG用于平滑肌细胞基因转染的可行性。1  材料与方法1.1  实验动物、试剂和仪器 一月龄新西兰兔；小鼠成纤维细胞NIH3T3(美国迈阿密大学外科实验室)；DMEM培养基(Hyclone公司)；小牛血清(杭州四季青生物技术材料研究所)；胰蛋白酶(Sigma公司)；多聚季胺(polybrene)储用液(8g/L)(Sigma公司)；G418储用液(50g/L)(GIBCO/BRL)；CO2培养箱、无菌超净台、离心机、倒置显微镜。1.

8、2  细胞株和质粒 人293T细胞、293/GPG包装细胞系由余红博士馈赠；pCnBgSN3是lacZ基因的表达质粒；质粒pHIT604是鼠白血病逆转录病毒(murineleukemia retrovirus, MuLV)Gag和Pol蛋白的表达质粒；质粒pCVG2是疱疹性口炎病毒G糖蛋白(vesicular stomatitis virus G glycoprotein, VSVG)的表达质粒。所有质粒由美国迈阿密大学外科实验室余红博士提供。所有质粒DNA均用大肠杆菌DH5感受态细胞(TIANGEN BIOTECH)扩增，并用试剂盒(Valencia, CA)从大肠杆菌中

9、提取。1.3  方法一月龄大耳白兔用水合氯醛腹腔注射麻醉后，在无菌条件下，迅速将颈内静脉取出，盛入有PBS液的平皿中。洗净血块，剥除外膜，将血管翻转内膜面朝外，用刀片自上而下刮12遍，去除VEC。然后用显微镊撕下血管中膜的平滑肌层，将其剪碎(0.51mm3)，接种于培养瓶中，在CO2培养箱中放置2.53.0h，使组织块较牢固地黏附于瓶壁，加入含200mL/L新生牛血清的DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium, DMEM, Gibco)培养液，34d更换培养液一次。细胞生长形成致密单层时，用1.25g/L胰蛋白酶消化，按12比例传代培养，56d可继续

10、传代一次5。实验采用第24代细胞进行研究。含100mL/L灭活胎牛血清(杭州四季青生物制品研究所)，2mmol/L谷氨酰胺，100mg/L青霉素及100mg/L链霉素的DMEM培养液，置37，50mL/L CO2，饱和湿度的CO2培养箱中培养，隔天半量换液，细胞为对数生长期，存活细胞百分率95%(台盼蓝拒染法)，备用。MuLV及MuLV/VSVG载体均参考三个质粒短暂转染体系3方法生产，二者均含有2半乳糖苷酶报道基因。293T/17细胞(美国迈阿密外科基因实验室冻存，1×106个细胞/10cm直径培养皿)。采用改良磷酸钙沉淀转染法。MuLV加入质粒DNA pCnBgSN，pHIT60

11、和pCAE各10g；MuLV/VSVG则加入质粒pCnBgSN，pHIT60和pCVG各10g，转染16h后将细胞培养液更换为含有10mmol/L sodium butyrate(Sigma)的培养基，12h后，以6mL新鲜培养基替换原培养基，以生产病毒，培养12h后，收获含有病毒颗粒的上清，0.4m的滤器过滤后分装，-70保存，备病毒滴度测定及转导。采用G418克隆筛选法6：第1天，将NIH3T3细胞放入30mm的六孔板中(5×104细胞/孔)；第2天，将病毒上清液与多聚季胺混存(终浓度为8mg/L)，滴度测定时以含有多聚季胺的DMEM培养液以110梯度稀释上清，循六孔板以16孔序号形成10-110-6个稀释浓度；第3天，以3mL含0.8g