猪瘟标记疫苗研究现状.docx

1、i专论与讲座%猪瘟标记疫苗研究现状邹海涛撤，兰邹然2，姜平I(1.南京农业大学动物医学院，江苏南京210095,2.山东省动物疫病预防与控制中心，山东济南250022)摘要：猪瘟是一种严重危害养猪业的烈性传染病，病死率很高，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物传染病。在我国，猪瘟弱毒疫苗的应用一定程度上控制了该病的暴发和流行，但是目前尚没有方法可以区别猪瘟疫苗免疫抗体和野毒感染抗体，猪瘟病毒的隐性感染和散发仍然影响我国生猪产品质量及出口。因此，新型猪瘟标记疫苗的研制成为目前猪瘟防控工作的迫切需求。论文在介绍猪瘟病毒分子特征及传统疫苗的基础上，对国内外新型猪瘟标记疫苗研究取得的进展进行

2、了系统的阐述。关键词：猪瘟；猪瘟病毒；标记疫苗中图分类号:S852.659文献标识码：H文章编号：1007-5038(2011)11-0111-05猪瘟(Classicalswinefever,CSF)是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)引起的以急性出血和发热为主要特征的烈性传染病，病死率很高，对养猪业危害极大，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物传染病。近年来，该病在美洲、亚洲、欧洲等国家和地区呈现复发的趋势，一些宣布已消灭猪瘟的国家(如德国、比利时等)又见猪瘟复发的报道。在我国，弱毒疫苗的广泛使用使猪瘟得到一定程度控制，发病率和病死率均明显降

3、低。但是弱毒疫苗最大的缺陷就是无法鉴别免疫抗体和野毒感染抗体，这使猪瘟的扑灭成为难题，导致目前猪瘟流行呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等现象。猪瘟的隐性感染/带毒现象加剧，导致继发和并发感染严重，药物使用大幅增加，食品安全问题日益突出。美国、欧盟等国家地区早已禁止使用猪瘟弱毒疫苗，它们选择通过扑杀来净化疫区。由于担心在普通免疫的“保护伞”下隐藏有猪瘟野毒，所以上述国家及地区往往不从任何有猪瘟疫情或注射猪瘟弱毒疫苗的国家进口生猪及相关产品，这对我国影响极大。况且C株疫苗已延用了半个多世纪，在长期的免疫压力下，猪瘟流行毒株已向远离疫苗毒的方向演化，猪瘟

4、弱毒疫苗的免疫效力也越来越多的受到质疑。因此，新型猪瘟标记疫苗的研制成为当前我国猪瘟防控工作的迫切要求。1.猪瘟病毒收稿日期：2011-05-27作者简介：邹海涛(1987-)，男.山东青岛人，硕士，主要从事动物传染病防治与检测研究。*通讯作者猪瘟病毒(CSFV)是一种有囊膜的正股单链RNA病毒，属黄病毒科(Flaviviridae).瘟病毒属(Pestivirus)。病毒基因组长约12.3kb,分为三部分,依次为5,无帽非编码区(5，UTR)、开放编码框(ORF)、3,无poly(A)尾非编码区(3-UTR)。CSFV的ORF可编码一个多聚蛋白，该多聚蛋白可被剪切为4种结构蛋白(C、Erns

5、、El、E2)以及8种非结构蛋白(N阿、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。其中E2蛋白是最主要的保护性抗原，它不仅是主要的B细胞抗原，同时也是重要的T细胞抗原。它也是CSFV毒力的决定因子之一，若将CSFV强毒株的E2基因进行替换，毒株的毒力将明显大幅减弱。E2蛋白在CSFV各毒株间的保守性要远低于E-*蛋白，其抗原性呈复杂性与多样性发展，因此CSFV在自然进化过程和长期的疫苗选择压力下，可能会通过改变其抗原性来逃避宿主的免疫监控，达到持续性感染的目的。Eg与CSFV对宿主细胞的嗜性以及致病性有密切关系，但并非CSFV复制所必须。有RNase活性，可降解病毒和细胞

6、的RNA。作为惟一分泌到CSFV感染细胞上清中的糖蛋白，在机体内可诱导产生中和谱很窄的抗体，使机体获得有限CSFV的免疫力。2新型猪瘟标记疫苗从20世纪90年代初开始，各国就开始通过不同的手段和方法来研发新型CSFV标记疫苗，诸如重组活载体疫苗、基因缺失疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗等，并取得了一定的进展。2.1重组猪瘪活载体疫苗某些病原体对宿主不产生致病作用，但是利用其内购在动物体内感染并复制的特点，我们可以将之改造为理想的疫苗载体。目的基因通过载体在宿主体内得到表达，从而产生长期的体液及细胞免疫应答。由于插入的目的基因只是原病毒基因的一部分，因此可以比较容易设计出相应的ELISA检测方法来区

7、分免疫动物与感染动物。2.1.1痘病毒栽体疫苗痘病毒（Poxvirus）的基因组较大，可以插入大片段的外源基因（超过25kb）,同时表达多个目的基因，且各基因表达彼此不干扰，遗传稳定。痘病毒仅在感染细胞的细胞质中进行复制，不会整合到宿主基因当中，不存在产生插入突变的隐患，具有较高的生物安全性。痘病毒具有多种感染途径，可以通过皮下、肌肉和黏膜等多种方式接种。从20世纪90年代起，国内外就开始利用痘病毒作为疫苗载体，进行猪痕标记疫苗的研究。VoigtH等6】首先对试验猪外周血中的淋巴细胞进行抑制性处理，然后采用多点肌下接种的方法使用重组口疮病毒ORFVVrV-E2对试验猪进行免疫。攻毒后，免疫猪未

8、表现出临床症状，血液中也未检测到CSFV存在。李谱华等则选择鸡痘病毒（Fowlpoxvirus）作为载体，将CSFV石门株的Era*和E2基因克隆入鸡痘病毒表达载体FPV-P11中，成功构建了重组鸡痘病毒，免疫猪后用100LD”的强毒进行攻击，结果显示免疫组保护率达到75%,为进一步研制猪痕活载体疫苗奠定了基础。2.1.2伪狂犬病病毒（PRV）栽体疫苗猪伪狂犬病病毒（PRV）基因组为单分子双股DNA,大小约为150kb,外源基因可以稳定的插入其中。目前，PRV基因缺失疫苗株多是通过缺失gE、gI、gG、gC、TK等非必需基因，现有的PRV基因缺失疫苗已在世界上广泛应用，安全性已得到了有效验证。

9、重组PRV还具有毒力不返强，易于与野毒区别的特点。因此PRV越来越多的被作为一种活载体，用以研制各类动物疫苗。PeeterS等将CSFVE2基因插入到PRVgE基因缺失突变株的gD位点，构建了表达E2蛋白的gE、gD双基因缺失重组病毒ID57.1。该重组病毒的复制仅局限于注射部位，从而消除了其水平传播的可能，提高了生物安全性。其后的攻毒保护试验中，接种动物接受致死剂慌的攻毒，存活率为100%。刘燕等将SV40启动子控制下的LacZ报告基因表达盒与分别在CMV启动子控制下的含有CSFVE2基因及PRRSVGP5基因的表达盒插入到PRVBartha-K61株TK基因中，通过蓝斑筛选获得了一株插入E

10、2、GP5与LacZ基因的柬组伪狂犬病病毒，命名为rPRV-E2-GP5°经Westernblot、间接免疫荧光试验证实E2、GP5基因在重组病毒感染细胞中获得表达。由此可以看出PRV载体在构建CSFV与其他猪病的多联疫苗上具有相当大的发展前景。2.1.3 腺病毒栽体疫苗腺病毒（AdV）载体具有可感染分裂和非分裂细胞、高滴度制备、易纯化、外源基因装载容量大等优点，故其现被广泛用于疫苗的设计。相关研究还发现在猪群感染AdV野毒并不会影响重组腺病毒疫苗的免疫效果口°】。这可能与疫苗包含了完整的AdV基因组有关。孙元等将CSFV石门株的E2全长基因片段，定向克隆到重组腺病毒AdE

11、asy-1系统的穿梭质粒pShuttle-CMV±,然后在大肠埃希菌与骨架载体AdEasy中进行同源重组，最后转染293细胞，成功包装出重组腺病毒rAdV-E2,分别在兔体和猪体上进行动物试验。试验结果显示兔体交换试验中的兔只未出现定型热反应，接种rAdV-E2的试验猪则能完全抵抗CSFV强度石门株的攻毒。目前，该研究已进入疫苗开发程序。何雷等口幻在此基础上将IL-2基因加入到腺病毒载体中，使之与E2基因共表达，其后的淋巴细胞转化试验和动物试验结果均表现了其良好的免疫效力。孙宏宇等日将PRRSV的GP5和CSFV的E2基因通过口稀疫病毒（FM-DV）2A序列连接，形成一个完整的ORF

12、,最后插入到腺病毒载体中，得到重组腺病毒rAdV-GP52AE2.间接免疫荧光试验和Westernblot证实2种蛋白均得到表达，小鼠免疫效力试验也取得理想的效果，故其有望开发为一种新型多联疫苗。2.1.4 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）载体疫苗作为CSFV的同属病毒，BVDV与CSFV具有明显的交叉反应性。CSFV仅以家猪和野猪为自然感染宿主，而BVDV则能够越过种间障碍感染包括猪、牛等一系列家畜和野生动物。BVDV-2中的一部分弱毒株对猪没有致病力，并且不能在猪群间传播。这些弱毒可以保护猪群抵抗CSFV感染，同时也不影响CSFV的血清学诊断。这表明一些BVDV弱毒株可能是CSFV标记疫苗的理

13、想载体。ReimannI等询以BVDV弱毒CP7株为框架，通过反向遗传学方法用CSFVAlfort/187株的E2基因替换CP7株的相应区段，构建了嵌合病毒CP7-/E2PacI,接种后可以保护猪只抵抗CSFV的致死性感染。对免疫后3周动物g清进行ELISA检测，结果只能检测到针对CSFVE2蛋白的特异性抗体，而检测不到针对CSFVE"蛋白的抗体。后来ReimannI等川】在此基础上又用CSFVAlfort/187株的E1、E2基因分别替换CP7的相应片段。为了使其与野毒相区别，他们又将CSFVE2基因中的抗原性表位TAVSPTTLR用BVDVCP7株的相应表位进行替换，从而获得重组

14、嵌合病毒CP7-ElE2aIf-TLAO在其后的攻毒保护试验中，该嵌合体虽然在免疫保护效力上与C株相差不大，但是并没有获得预想中与野毒的可区分性。总的来说，BVDV载体疫苗具有较高的免疫原性，但在配套检测和生物安全性上还有待验证和提高。目前国内尚无此类研究的报道。2.2基因缺失/突变疫苗随着对CSFV分子病毒学的发展，研究者们发现CSFV感染过程中诱导产生的抗体主要是与非结构蛋白NS3以及囊膜蛋白E-.E2发生反应。但是，NS3中所含的抗原表位在瘟病毒属成员中间具有相当高的保守性，很难进行鉴别区分博）。因此，£血和E2更适合作为基因缺失/突变位点来设计基因缺失疫苗。另外，敲除/突变C

15、SFV的其他基因区段（如NPe）也可减弱病毒毒力。卬皿是一种阻遏物，能够阻止dsRNA介导的细胞凋亡过程以及IFN-a/p的生成。在CSFV感染细胞中，它能够抑制IRF-3的转录表达MayerD等如使用鼠的泛素来替换村即，分别在强毒株Alfort/187和Eystrup的基础上，构建出了2个稳定的CSFV弱毒株。试验动物在接种一次弱毒以后能够抵抗强毒株Eystrup的攻毒。但NP"蛋白在感染动物体内产生的抗体并不能达到ELISA检测水平，所以N期基因缺失株必须同时进行额外的修饰来达到可鉴别的目的。HolinkaLG等口们则采用另一种思路设计出一种双标记弱毒疫苗。他们将一个名为“Fla

16、g”的标记性抗原表位插入到E1蛋白序列当中。同时他们对单克隆抗体WH303位于E2基因中的结合表位进行改造。由于该表位为CSFVE2特异性表位且具有高度的保守性，故他们选择将该表位敲除，最后拯救出重组病毒FlagT4v。其后的动物试验数据表明，该重组病毒接种后，仅需2d3d即可产生保护力对抗强毒Brescia株的攻毒。从接种动物血清样本中分离的抗体可以与Flag表位发生特异性结合，但不能与根据WH303表位合成的多肽结合，实现了可鉴别性。2.3DNA疫苗与其他疫苗相比，DNA疫苗具有一系列的自身优势:设计简单，易于进行修饰操作。能够同时诱导产生强力的体液和细胞免疫。安全性良好，不与野毒发生基因

17、重组，也不会整合到宿主基因组。不受母源抗体干扰。同时重组DNA质粒可通过发酵培养的方法来大量制备，又具有相对较好的稳定性，并且大容量的质粒还可同时容纳多种病毒的免疫原基因，因此，DNA疫苗技术具有广阔的发展前景。虽然是一种新兴疫苗，但DNA疫苗在猪瘟标记疫苗领域取得了相当大进展。李娜等河构建了基于甲病毒SFV复制子的DNA疫苗pSFVlCS-E2,随后的兔体交换试验和猪体攻毒保护试验均显示了良好的免疫保护效果。后来，赵和平等】又在PSFV1CS-E2中插入PRV的VP22基因，构建能够表达E2与VP22融合蛋白的衍变体pSFVlCS-E2,然后与PSFV1CS-E2-UL49分别接种小鼠，进行

18、对比。结果发现衍变体PSFV1CS-E2-UL49产生的细胞免疫要明显强于PSFV1CS-E2.这暗示PRV的VP22基因能够有效增强DNA疫苗的免疫原性。万超等西发现Toll样受体调节分子TRIF也能够增强DNA疫苗的免疫效果。这些发现为如何提高DNA疫苗的免疫原性带来了新思路。孙元等E-24J则针对DNA疫苗抗原性低、起效慢等弱点，设计了基于DNA疫苗和重组腺病毒载体疫苗的Prime-boost联合免疫策略，并进行了动物试验评估，为DNA疫苗的实际使用提供了参考。另外，E2蛋白跨膜区（TMR）在DNA疫苗上的作用一直存在争议。这些争议可能是由于试验体系不同所造成的。缺失跨膜区可以使抗原更容

19、易分泌到细胞外的空间，加强了体液免疫应答；反之，则侧重于将E2蛋白保留在细胞膜上递送给T细胞.加强细胞免疫应答。2.4亚单位疫苗E2亚单位疫苗是最早投入使用也是目前惟一投入使用的猪瘟标记疫苗，其商品化产品为德国拜耳医药出品的BAYOVAC®CSFmarker和荷兰英特威公司出品的Porcilis®Pesti,前者早在1998年即已被列入欧洲药典。在E2蛋白基础上开发的亚单位疫苗不仅能够对抗CSFV野毒株，而且很容易通过检测抗Em，蛋白的抗体将免疫的和感染的猪区分开来。国外普遍采用杆状病毒-昆虫细胞系统来对重组E2蛋白进行高水平表达。重组蛋白在昆虫细胞内能够得到糖基化等加工处

20、理，所得产物具有天然构象，生物活性高。张文杰等采用与国外相同的杆状病毒-昆虫细胞技术路线取得成功。2009年台湾研究者利用巴斯德毕赤酵母系统成功的表达重组E2蛋白，并在其后的动物试验中也取得成功I”】。不过，亚单位疫苗的缺陷也很明显。目前来看，亚单位疫苗虽然具有良好的个体保护效果，但其接种动物血清中的E2抗体滴度上升较慢，也不能阻止CSFV病毒的水平传播。而且接种动物血清中的E"抗体在接种后短时间内无法达到可检水平，这就造成了配套抗体鉴别检测相当大的局限性。国内外许多机构正在研究改进亚单位疫苗的佐剂以及配套的ELISA检测，取得了一定的进展，为亚单位疫苗的发展带来了一丝曙光。如果在今

21、后的研究中能够解决亚单位疫苗的上述缺陷，亚单位疫苗的实际应用必然会达到令人满意的效果。3展望随着兽医生物制品技术的日新月异，CSF标记疫苗也随之不断发展。虽然CSF标记疫苗取得了长足进步,但各种备选疫苗都还存在一定缺陷，比如免疫原性、配套DIVA(differentiatinginfectedfromvaccinatedanimals)血清学检测、造价、抗体效价等，阻碍了其投入应用的进程。因此今后CSF标记疫苗的研究不仅是开发新的具有可行性的CSF标记疫苗设计策略，更重要的是要逐步解决已有备选CSF标记疫苗的优化问题，使其能够真正的形成商品化产品，用来有效控制和预防CSF的暴发和流行,乃至彻底

22、消灭CSF。各国研究者已经对此进行了一定探索，主要内容包括疫苗佐剂的选择和优化、Prime-boost联合免疫策略的应用、检测方法改进等。疫苗的设计策略是多种多样的，我们万网很难确定哪种方案才是最理想的选择。在不同的研究中，疫苗剂量、免疫次数、免疫途径、免疫攻毒之间的时间间隔均不相同，攻毒所用试验动物、病毒毒株、攻毒剂最与途径以及用来评估疫苗效果的标准也不相同。因此笔者认为非常有必要根据上述因素建立一套通用的CSF疫苗效果评估参考标准，以此标准来对不同的CSF标记疫苗策略进行评估，从而选择最适合我国猪瘟防控需求的疫苗策略。参考文献：1 谢S.A华.新型猪瘟疫苗研究进展J.动物医学进展.2008

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