梅毒疫苗的研究进展.docx

1、综述*梅毒疫苗的研究进展姚玲综述；曾铁兵审校(南华大学病原生物学研究所，湖南衡阳421001)摘要:梅毒是由梅毒螺旋体(Tp)感染所引起的性传播疾病。梅毒感染可引发机体多系统慢性持续性损害,可垂直传播，还可明显增加感染和传播艾滋病的危险性。尽管付出相当的努力，但Tp不同寻常的生物学特征及当前梅毒疫苗方法学的不足严重阻碍了梅毒疫苗的研究进程，迄今为止，国内外仍然没有切实有效的疫苗能预防Tp感染。简要介绍了梅毒感染后机体免疫应答特点，综述了梅毒疫苗的类型及疫苗发展中可能存在的障碍，并进一步提出了今后梅毒疫苗设计的新方向。关键词:梅毒;苍白密螺旋体;疫苗;外膜蛋白中图分类号：377*.1文献标志码：

2、A文章编号：1005-5673(2013)01-0065-05ResearchprogressinsyphilisvaccineYAOLing,ZENGTie-bing(InstituteofPathogenicBiology,UniversityofSouthChinatHengyang,Hunan4210011China)Abstract:SyphilisisasexuallytransmitteddiseasecausedbyinfectionwithTreponemapallidum(Tp).Typicallytheorganismistransmittedthroughsexualc

3、ontactorverticallyfromaninfectedmothertoachild,whichcannotonlycausechronicandpersistentdamagetomultipleorgansandsystems,butalsoincreasetheriskofinfectionandspreadofAIDS.Despiteintensiveefforts,theunusualbiologyofT.pallidumandthedrawbacksofthecurrentmethodologyhavehinderedseriouslyprogresstowardsthed

4、evelopmentofasyphilisvaccine.Sofar,bothathomeandabroad,thereisstillnoeffectivevaccinetopreventTpinfection.Thisreviewbrieflydescribestheoverviewofimunitytosyphilis,outlinesthemaintypesofsyphilisvaccineandpossibleobstaclestodevelopmentasyphilisvaccineandproposesnewdirectionsinthedesignofa7Lpallidumvac

5、cine.Keywords:Syphilis;Treponemapallidum;Vaccine;Outermembraneprotein梅毒是由苍白密螺旋体苍白亚种(Treponema,pallidumsubspecies,pallidum,Tp)俗称梅毒螺旋体引起的一种慢性性传播疾病(Sexuallytransmitteddisease,STD)O在自然界中，人是Tp的唯一宿主。梅毒主要经性接触传播或母婴垂直传播，未经治疗的成人梅毒一般会经历一期、二期、潜伏期和三期几个阶段，三期梅毒可侵犯包括神经系统、心血管和骨骼在内的几乎所有脏器，具有致死性。梅毒易于诊断和治疗，且Tp对一线药物青霉素收

6、稿日期：2012-10-25;修回日期：2012-11-28基金项目：国家自然科学基金项目(81273322)；湖南省自然科学基金重点项目(11JJ2044)；湖南省科技厅重点项目(2O1OFJ2OO8)作者简介:姚玲(I986-),女，硕士研究生，主要从事梅毒疫苗研究。通信作者：曾铁兵,副教授，硕士生导师.主要从事梅毒疫苗研究。E-mail：nhdxztb不耐药，然而，梅毒的感染率和发病率近年仍呈快速上升趋势,只有研发能彻底清除Tp感染、防止梅毒发生和传播的疫苗才是最终消除梅毒的根本措施，但迄今却无切实有效的梅毒疫苗问世。阻碍梅毒疫苗发展的主要因素与Tp特殊生物学性状密切相关:Tp尚不能体外

7、人工培养，难以获得大量螺旋体;Tp缺乏能进行“敲出”或“敲入”的基因系统,因此不能检测各基因产物的功能;Tp与典型革兰阴性细菌不同的特殊细胞结构，如稀有的外膜蛋白，易脆的外膜(易被理化因素破坏)及细胞壁肽聚糖层特殊位置(覆盖内膜)等。1抗Tp感染免疫特点目前普遍认为，人自然感染梅毒后获得的免疫为有菌免疫，即当体内存在活Tp才有免疫力，待清除Tp后易被再感染。须注意区分完全清除体内Tp（带菌免疫）和预防梅毒（无菌免疫）是不同的。家兔模型表明，延长感染时间（3月）可激发无菌免疫。因此，亦有可能在人为控制的情况下激发人体无菌免疫。早期研究证明，在感染Tp家兔模型中，被动转移免疫血清可预防或减缓皮损的

8、发展，这也许表明在梅毒感染过程中能产生针对Tp某些部位的抗体，短暂抑制梅毒硬下疳的发展。此外，特异性抗Tp血清能阻止Tp吸附于培养细胞表面;在补体存在时，免疫血清能抑制Tp活动。1.1抗体的作用Tp活动:家兔免疫抗体能体外调理巨噬细胞对Tp的吞噬作用，但这种调理作用明显慢于其他细菌，而且有部分Tp能逃避调理作用而引起慢性感染。由此可见，抗体在早期阻止Tp粘附上皮细胞及防止向远处组织播散、特异性增强巨噬细胞吞噬杀伤、最终在清除Tp中发挥重要作用。1.2T细胞及活化巨噬细胞的作用目前普遍认为Tp是胞外菌，因此,CD8CTL可能在清除感染部位胞外Tp的意义不大。相反，CDTTh细胞分泌细胞因子,在辅

9、助B细胞产生抗体及激活巨噬细胞中起关键作用。研究显示，在感染早期,Tp的清除是Thl细胞分泌细胞因子激活巨噬细胞的结果m，如果过早转化为Th2型免疫应答可能引起巨噬细胞数量减少而导致慢性感染【妃。然而，巨噬细胞的吞噬作用缺乏特异性，仅靠巨噬细胞难以全部清除大量广泛播散的Tp,还需要抗体的调理作用协助清除Tp。而且Thl型免疫应答的极化不利于调理性抗体的形成，并能引起梅毒免疫病理。因此,可考虑在疫苗中加入Th2极化的佐剂或Th2型细胞因子以诱导抗体产生，从而完全清除Tp感染。1.3明膜免疫Tp可通过破损皮肤或穿透完整黏膜引发感染，疫苗所引发的系统性免疫反应不一定能对黏膜产生攻击，黏膜局部产生的S

10、IgA和Thl细胞对阻止早期Tp局部感染和清除Tp极其重要。因此,有效的Tp疫苗必须能同时诱导系统性免疫和黏膜免疫然而目前对Tp感染的黏膜免疫了解甚少，应开展广泛深入的研究，在疫苗设计中予以充分考虑。2梅毒疫苗类型2.1全细胞疫苗早在20世纪70年代,Miller等建立家兔感染模型，将经y-射线照射灭活的Tp大景反复静脉注射兔子体内，经历37周获得了完全保护，激发长期无菌免疫。但其免疫时间过长、繁琐且费用昂贵，而且不可大量生产全细胞Tp疫苗。因此,全细胞Tp疫苗应用于人不切实际，但为今后研发诱导完全保护性的梅毒疫苗提供了可行性。2.2减毒活疫苗减毒活疫苗的优势在于免疫接种一次剂量即可刺激机体全

11、身性免疫和黏膜免疫。缺乏体外培养系统和仍不明确的Tp基因敲除方法成为发展Tp减毒活疫苗的最大障碍,可考虑使用与Tp极度相似且对人不致病的螺旋体代替Tp作为减毒活疫苗的免疫原，但目前还不能证实替代品能否产生交叉免疫保护作用，即使有了活疫苗，也不能用于免疫缺陷的人群，如HIV感染者。2.3重组亚单位疫苗重组DNA技术的发展使大规模生产Tp重组蛋白成为可能。重组蛋白安全、易于获得，将取代全细胞疫苗和减毒活疫苗，但目前DNA技术生产重组糖类和脂类抗原仍存在技术性上的难题。2.3.1外膜蛋白疫苗限制亚单位疫苗研发速度的关键原因之一是相关保护抗原的确定。由于Tp不能在细胞内繁殖,CTL作用甚微，对其清除主

12、要依赖于特异性抗原活化的Thl细胞激活巨噬细胞，以及Th2细胞辅助B细胞产生的抗体的特异性调理吞噬及抗粘附作用等，从而认为候选保护性抗原最可能暴露于完整的Tp表面的抗原,如外膜蛋白。然而,Tp独特的细胞形态学结构很大程度上限制了Tp外膜蛋白的确定。首先，以冷冻断裂电子显微镜和低温电子断层扫描技术显示,Tp跨膜外膜蛋白十分稀少；其次,Tp外膜十分脆弱，物理方法处理很容易破坏外膜完整结构从而改变了蛋白的天然位置，采用常规检测方法如免疫电镜技术难以确定外膜蛋白的确切位置。而且，基因组分析表明，除了Tp92（TpO326）外,Tp基因组不编码任何与已知革兰阴性菌外膜蛋白相似的蛋白目前已对内鞭毛蛋白、4

13、D、Gpd、TmpB、Tp92（Tp0326）、TpN15、TpN47、TprF,TprI、TpO155、TpO483、TpO956、TpO136等10余种假想Tp外膜蛋白的免疫保护性进行了评价m，还有几种很有希望的候选外膜蛋白疫苗分子的保护作用正在评价中，如Tp0751、TpO453等，这些疫苗免疫分子大多具有一定的保护性，但迄今为止无一能诱导完全的保护作用，可能是与这些假想的外膜蛋白并非真正位于Tp表层有关。随着一些新的方法学的开展，许多以前认为位于Tp表面的如TpN47、TpN17、TpN15蛋白被实际确定位于内膜表面，几种最可能位于Tp外层的Tp92(Tp0326)、Tp0971、Tp

14、rF、TprI、TprK、Tp0136等外膜蛋白，在其外膜表层的位置仍存有争议而未被真正确定9，需要采用多种更为先进的检测技术加以确认。确定已发现和新发现Tp外膜蛋白是梅毒疫苗研究的首要任务，也是疫苗研发的前提和基础。2.3.2抗粘附疫苗目前普遍认为Tp感染宿主细胞过程中的第一步是粘附,也是最为关键的一步，抗Tp黏附素的抗体可阻止Tp粘附和(或)播散。体外证实家兔免疫血清与Tp预孵育可阻止其吸附培养的宿主细胞。至今已有多个潜在Tp外膜蛋白被证实能吸附宿主细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM),如TpO155.TpO483C10和Tp0136能结合宿主纤连蛋白，Tp0751

15、能结合层黏连蛋白3?。结合纤连蛋白或层黏连蛋白在许多病原体致病过程中是至关重要的一步。在这四种候选黏附素中，Tp0751证实能阻止Tp吸附层黏连蛋白，其抗血清能预防Tp在单层培养细胞间播散,TpO136免疫家兔能延缓溃疡发生但不能阻止感染或皮损形成，而以重组Tp0155和Tp0483免疫家兔却未显示出其保护作用。2.3.3核酸疫苗核酸(DNA)疫苗以其难以比拟的优势在现代疫苗研究中发挥越来越重要的作用。与灭活疫苗和减毒活疫苗相比,DNA疫苗能产生更强更持久的体液免疫和细胞免疫应答。迄今为止，核酸疫苗已广泛应用于HIV,5A乳头瘤病毒:技等疾病的研究。然而,核酸疫苗免疫原性低下大大限制其发展，选

16、择合适的核酸疫苗载体和佐剂能显著提高基因的转染率和基因在哺乳动物细胞内的表达水平。国内Zhao等首次将核酸疫苗应用于Tp疫苗研究，选用IL-2作为免疫佐剂与Tp92(Tp0326)或Gpd(TpO257)共表达于真核表达载体pcDNA3.1(+),用壳聚糖包裹该载体后对家兔进行肌内注射，结果显示壳聚糖与佐剂的联合应用能显著提高其免疫保护效应l，7-，8o2.3.4非蛋白亚单位疫苗糖类抗原疫苗。已经证实G菌的脂多糖(LPS)和脂寡糖(LOS)表面部分可引发免疫保护作用，但Tp和伯氏疏螺旋体(Borrelia6竹gdo决冷)基因组缺乏编码LPS和LOS的基因，因此LPS和LOS不在Tp疫苗制备的考

17、虑范围。然而许多病原菌，如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、沙门菌，将其纯化的多糖与载体蛋白相结合能制备高效疫苗。毋庸置疑，蛋白被糖基化修饰将影响到某些表位或者整个蛋白的免疫原性。原核生物蛋白一般均需进行糖基化修饰,Tp具有的糖蛋白也是如此，若能鉴定出Tp的糖基化蛋白，将可有助于制备疫苗激发保护性免疫反应。脂类抗原疫苗。近年来，脂类抗原被认为在感染引起的免疫应答中起着重要作用【史，现已确证的大部分脂类抗原为分枝杆菌的细胞膜或细胞壁组分，但仍不十分清楚针对这些抗原的免疫应答是否在免疫保护中具有重要作用。有研究表明，抗Tp单克隆抗体能结合一个可能位于Tp表面的磷酰胆碱表位叫，该单抗在补体存在

18、的条件下能杀伤Tpo使用磷酸胆碱全抗原刺激机体可能会诱发自身免疫,因为在宿主中也存在该抗原，但该单抗能识别的磷酰胆碱表位是Tp所特有的，因此针对该Tp特异性表位疫苗具有发展的前景。3梅毒疫苗免疫保护性的影响因素及疫苗设计对策除了Tp外膜蛋白本身外，抗原构象、疫苗分子协同效应、接种策略、佐剂和免疫途径等也是影响免疫保护性效果的重要因素。3.1蛋白抗原天然构象制备Tp疫苗的主要抗原是外膜蛋白，这些蛋白已经过翻译后修饰，但E.coll高水平表达的重组蛋白可能难以精确呈现经翻译后修饰的天然Tp蛋白构象。对于某些抗原而言，蛋白翻译后修饰对其免疫原性起到关键作用，尤其是某些蛋白构象表位,例如伯氏螺旋体脂质

19、分子在非天然蛋白状态下无免疫原性。可以通过以下策略使表达的蛋白更加接近天然状态，如选用低水平表达或低拷贝数的载体,以防止蛋白包涵体的形成;用天然E.coli外膜蛋白信号肽序列替代Tp非典型信号肽序列，使表达的蛋白定位于外膜,这对于表达预测具有，桶样结构蛋白至关重要。这样，表达Tp膜形式蛋白的&功0的整个外膜可在家兔模型中用于检测候选抗原的保护性。该方法的缺陷是，天然Tp蛋白折叠机制可能与Ecoll不会相同，而且外膜不同结构组成可能会影响蛋白构象。虽然目前还不能确定其影响大小，但有学者利用E.coli外膜蛋白信号肽序列在载体(pDUMP、pCATCH)中重组表达螺旋体脂蛋白)，结果显示重组蛋白与

20、天然螺旋体蛋白间存有轻微差异。3.2疫苗分子间协同效应采用两种或两种以上的免疫原可能具有协同作用，可以提高其保护水平。目前在梅毒疫苗研究领域中大多是对单一免疫原保护作用进行的评价，能否可考虑针MttTp的感染特点，如抗粘附、促进调理、激活巨噬细胞等将Tp抗原保守区域的多个具有免疫保护作用的表位进行串联,设计多价表位疫苗，从多个环节抗感染着手以获得全面完整性的保护，有待今后探讨。3.3以减毒活菌作为疫苗载体在减毒细菌中异源表达Tp蛋白有不少潜在优势:减毒活菌免疫后能激发黏膜免疫,这可能在梅毒的性传播过程中发挥重要作用；利用减毒肠道病原体也有可能异源表达具有天然构象的蛋白；利用这类病原体局部免疫可

21、能会剌激产生强烈的、更类似自然感染的免疫应答。3.4初免加免的接种策略以DNA初免再加以相同蛋白加强免疫,这种新型序贯免疫策略比传统的同一类型的抗原或DNA多次免疫更为有效，被认为是当前最有效的免疫策略以?！，机制尚不明确，可能采用这种序贯免疫方式能诱导广泛的体液免疫和细胞免疫效应分子，引发更为强烈的免疫应答有关。这种接种策略在国内赵飞骏等所采用的梅毒核酸疫苗接种中显示比单一DNA或蛋白免疫激发更为有效的保护作用。3.5佐剂选择和免疫途径佐剂可增强或调节机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型，如霍乱毒素黏膜佐剂的使用可成功引发其他病原体的黏膜免疫】。在梅毒DNA疫苗中与目的蛋白抗原共表达佐剂

22、IL-2能明显增强Thl型免疫应答,7-18,获得较好的保护作用。近年来，菌影(Bacterialghost,BG)作为天然靶向免疫刺激佐剂引起关注,BG具有强大的外源DNA和外源重组蛋白抗原装载递送能力，采用口服、鼻内和吸入的黏膜免疫途径或肌注，都可诱导高水平的黏膜免疫应答和引起全身性体液免疫与细胞免疫应答，且能维持持久免疫记忆。目前已被广泛地用于沙眼衣原体、幽门螺杆菌、HIV等许多病原体的疫苗及佐剂载体可为梅毒疫苗佐剂的选择提供参考。同样,免疫途径也是免疫应答类型的影响因素之一，例如足部和背部皮下注射某种特定抗原，其免疫反应会偏向Thl或者Th2型免疫应答。因此，在免疫前应根据诱导免疫应答

23、的类型，选择合适的佐剂和免疫途径。3.6疫苗攻击模型豚鼠、仓鼠、灵长类和家兔都曾应用于Tp感染动物模型的研究。豚鼠、仓鼠感染Tp需要接种剂量大、但不易感染;灵长类动物作为Tp感染动物模型较难以获得;而家兔因具有对Tp易感、感染症状类似于人的感染且易于观察等优势而成为最佳选择。家兔感染Tp模型与人感染最明显的不同是,家兔再感染Tp配合抗生素治疗能建立完全免疫，而人却不能。近年来家兔基因组的序列已明确，为动物模型的应用提供了极大便利，但目前缺乏家兔种属特异性免疫试剂。对梅毒疫苗的研究还比较零散，缺乏一个标准化的Tp抗原制备以及接种与攻击的标准化操作程序，这可能对同一个免疫保护分子的保护性评价在不同

24、实验室间缺乏可比性，这种标准化操作程序亟待建立。4小结最有希望诱生机体免疫保护性的Tp抗原是表面暴露的外膜蛋白。理想的梅毒疫苗应能激发细胞免疫和体液免疫应答，在设计梅毒疫苗时应以外膜蛋白为靶位,结合先进的疫苗投递方法学,如保持抗原天然构象、进行相关的蛋白翻译后修饰、选择合适的免疫途径和免疫佐剂等，诱导全身性和局部黏膜的持久免疫以获得最佳保护性免疫。梅毒全球流行且缺乏有效公共卫生措施阻止该病发展，有效梅毒疫苗的产生不仅能直接减少梅毒感染和先天梅毒发病率,而且能间接降低新发HIV感染的机率。参考文献1jHoEL,laikehartSA.Syphilis：usingmodemapproachesto

25、uder-standanolddiseaseJj.JClinInvent,2011,12(121):4584-4592.2 CullenPA,CameronCE.Progresstowardsaneffectivesyphilisvaccine:thepast,presentandfuture:J.ExpertRevVaccines,2006,5(1)：67-80.3 VanVoorhisWC,BarrettLK,KoelleDM,etal.Primaryandsec-ondarysyphilislesionscontainmRNAforThlcytokines.J.InfectDis,199

26、6,173(2)：491-495.4 FitzgeraldTJ.TheThI/Th2-likeswitchinsyphiliticinfection:isitdetrimentalrJ.InfectImmun,1992,60(9：3475-3479.5 RadolfJD.NorgardMV,SchulzWW.OutermembraneultrastructureexplainsthelimitedantigenicityofvirulentTreponemapallidumJ.ProcNatlAcadSciUSA,1989.86(6):2051-2055.6 LiuJ,HowellJK.BradleySD.CellulararchitectureofTreponemapallidum:novelflagellum,periplasmiccone,andcellenvelopeasrevealedbyciyoelec