蛋白质电泳操作步骤

1、SDS-PAGE 电泳操作步骤：试剂配制：（实验中采用均为分析纯）（ 1）丙烯酰胺贮液（ 4下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）丙烯酰胺贮液（T=30%， C=3%）称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml,过滤备用。（试剂有毒，操作中注意防护）（ 2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl， pH 6.8） （ 4下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节 pH至6.8,再用双蒸水定容至 50 ml。（ 3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl， pH 8.8） （ 4下棕

2、色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8,再用双蒸水定容至 100 ml。（ 4） 10% SDS（ 5） 10% 过硫酸铵（APS） ：使用前新鲜配制，低浓度APS 一般当天用当天配制，勿过夜使用。（ 6）尿素（ 7） TEMED（N， N， N ， N -四甲基乙二胺）（8）电极缓冲液（1（棕色瓶中4c储存，一般使用3-4次）0.025 mol/L Tris， 0.192 mol/L 甘氨酸，0.1% SDS， pH 8.3（9）电极缓冲液（2（棕色瓶中4c储存，一般使用3-4次）0.050 mol/L Tris， 0.38

3、4 mol/L 甘氨酸，0.1% SDS， pH 8.3（ 10）样品缓冲液（pH 6.8） （ 4下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）1.6 ml 浓缩胶缓冲液（pH 6.8） + 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫苏糖醇（DTT） + 2.5 ml 87%甘油+0.1 mg澳酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml.（ 11）考玛斯亮蓝R-250 染色方法：a.固定液20%三氯乙酸b.脱色液250 ml 乙醇， 80 ml 冰醋酸，加水稀释至1000 ml。c.染色液称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中样品处理：处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20下。d.C

4、ytC酶解样每管分别加入 8 l 细胞色素 C (20 mg/ml), 10 ul 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) ,1胰蛋白酶(细胞色素C:胰蛋白酶=50: 1)。37c水浴，2 h0立即放入-20 C冰 箱冷冻保存备用。上样前加15小比样BUFFER, 75c水浴5-10min)大肠杆菌蛋白取10仙杳程菌种接入10nmi LB液体培养基里，过夜培养12h,取出1ml菌液离 心 10000g/r, 5min。弃上清，用 1ml Tris-Hcl (pH 8.0 50mM)洗涤 1-2 次，后 分别加入 20?(pH8.0 5mM)、10EDTA, -20C保存。上样前加入 2

5、?5%X, 再力口入50仙比样BUFFER, 75c水浴5-10min.CytC15?CytC 加入 15n?H¥ BUFFER, 75c水浴 5-10min0 .低分子量肽标准取 8-10N?Maker (2mg/ml)，加入 10N？¥ buffer,再加入 5?ddH2O, 75 c 水 浴 5-10min.SPI多肽的制备I材料及试剂(试剂均为分析纯) 纯大豆粉木瓜蛋白酶(sigma P3250 500-2000AU/g)正己烷 巯基乙醇Tris-HCl 缓冲液（0.03 M 、 pH 8.0 ）0.2 M HCl 叠氮钠 考马斯亮蓝G250标准牛血蛋白 n制备方法

6、i .SPI制备：大豆分离蛋白的制备参照Iwabuchi和Yamauchi 9的方法，具 体步骤如下：全脂豆粉加正己烷（1/5）室温下搅拌1 h脱脂，于3 000 g离心5 min, 取沉淀反复脱脂两次，于沉淀中加入1520倍含10 mM 琉基乙醇0.03 M、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，室温搅拌12 h,于20 C 6 000 g 离心25 min,取 上清液,用 0.2 M HCl 调节 pH 至 4.8, 置于冰箱下层冷沉过夜, 再于 4 9000 g 离心 20 min, 取沉淀分散于少量水中, 调节 pH 至 7.0, 搅拌 1 h 充分溶解后于 4 下用含 0.05 %

7、叠氮钠的蒸馏水透析2 d, 再用蒸馏水透析两次去叠氮钠 , 冷冻干燥即得大豆分离蛋白（SPI）。 （可能透析会损失掉一定量的多肽。）ii.SPI蛋白含量测定：利用考马斯亮蓝蛋白含量测定法，根据牛血蛋白作出的标 准蛋白曲线，测定SPI的蛋白浓度：（具体方法参见生物化学实验原理和方法P174)0 00.010.020.030.040.050.06蛋白浓度标准蛋白曲线一吸光度-线性(吸光度)6114 2 1 8 6 4 2 S c5ss度光吸测得1% (1mg/ml )的SPI吸光度为0.779 ,求得即在SPI质量分数为1%的情况 下，其蛋白浓度约为3mg/ml.iii.SPI多肽制备：本实验采用

8、木瓜蛋白酶水解SPI,制取SPI多肽。标准的酶解体 系为溶于0.05 mol/L, pH8.0Tris-HCl 缓冲溶液的SPI溶液(质量分数为2%), 含质量分数为0.05%的叠氮钠，先于38 c下预热5 min,分别添加蛋白酶至750 AU/mL ,然后继续于反应温度下反应，反应时间也很影响 SPI多肽的产率，木瓜 蛋白酶持续低温水解16小时也可以产生较多小肽。反应混合物可定期取样并分 别加入X- PAGE样品缓冲液终止反应(1:1, v/v)。实验上样一般采用过夜酶解透 析样(2%*5%)。上样前应将酶解样与样品缓冲液混合物水浴。操作方法：所制均为1.0mm小板所需体积(1)配制分离胶(

9、16.5%T, 3%C):丙烯酰胺贮液一3ml分离胶缓冲液一1.5ml 尿素一2.16g 10%SDS 72小？ (2)配制浓缩胶(4%T, 3%C)丙烯酰胺贮液 一0.34ml浓缩胶缓冲液 一0.24ml ddH2。一 1.4ml 10% SDS 24 1 (3)将上两步配制的分离、浓缩胶真空抽气15min,同时配制10%过硫酸俊： 准确称量0.1g过硫酸俊固体(因其易氧化，操作尽量快，且尽量从底部取样 )， 溶于1ml双蒸水中，即配即用，低浓度 APS只限当天使用。(4)吸取22M过硫酸俊及5MTEMED于分离胶中，轻轻混匀，灌胶，小心的 在分离胶的表面加封一层水，封住胶面。注意分离胶与浓

10、缩胶的比例。(5)大约40min,待分离胶聚合形成界面后，吸掉水，加11M过硫酸俊及4 plTEMED于浓缩胶中，轻轻混匀，灌注浓缩胶，慢慢斜插入梳子(以免产生气 泡)。胶配制完成之后可直接放置于室温下，而且切忌即配即用及4c下冷藏，应使其充分凝固，这样可以在一定程度上提高分辨率。(6)样品处理【此省略】(7)上样：将处理好的样品依据其蛋白浓度加入上样 buffer,水浴后离心，去 适量体积加入上样孔内，切忌样品直接互相污染( 上样量一般8-12闺，视样品 不同而异)(8)电泳：将电极缓冲液注入电泳槽中。恒流情况下，电压一般设为最大值(300V), 在分离胶内电流一般为10mA左右，大约30m

11、in左右，样品前沿跑过分、浓界面 后，电流加大为20-25mA,整体电泳时间约2 h;恒压条件下，浓缩胶内电压取 60V,电流一般设最大值，样品跑至分、浓界面后电压加大到120V,整体电泳时间约2.5h。(9)染色：利用考玛斯亮蓝 R-250染色系统固定、染色和脱色：电泳完毕后， 将胶置于固定液中固定1 h,然后放置于染色液中染色过夜，转置脱色液中脱色， 并多次更换脱色液，直至背景清晰。(10)观察分析电泳结果1一 月二月三月产品名称数量金额利润产品名称数量金额利润产品名称数量金额利润合计合 计合 计四月五月六月产品名称数 量金 额利 润产品名称数 量金 额利 润产品名称数 量金 额利 润合计

12、合 计合 计下午 13 : 00 17 : 00B-实行不定时工作制的员工，在保证完成甲方工作任务情况下，经公司同意，可自行安排工作和休息时间。3.1.2打卡制度3.1.2.1 公司实行上、下班指纹录入打卡制度。全体员工都必须自觉遵守工作时间，实行不定时工作制的员工不必打卡。3.1.2.2 打卡次数：一日两次，即早上上班打卡一次，下午下班打卡一次。3.1.2.3 打卡时间：打卡时间为上班到岗时间和下班离岗时间；3.1.2.4 因公外出不能打卡：因公外出不能打卡应填写外勤登记表，注明外出日期、事由、外勤起止时间。因公外出需事先申请，如因特殊情况不能事先申请，应在事毕到岗当日完成申请、,由直接主管

13、签字证明当日的出勤状况，报部门经理、审批手续，否则按旷工处理。因停电、卡钟（工卡）故障未打卡的员工，上班前、下班后要及时到部门考勤员处填写未打卡补签申请表人力资源部批准后，月底由部门考勤员据此上报考勤。上述情况考勤由各部门或分公司和项目文员协助人力资源部进行管理。3.1.2.5 手工考勤制度3.1.2.6 手工考勤制申请：由于工作性质，员工无法正常打卡（如外围人员、出差），可由各部门提出人员名单，经主管副总批准后，报人力资源部审批备案。3.1.2.7 参与手工考勤的员工，需由其主管部门的部门考勤员（文员）或部门指定人员进行考勤管理，并于每月 26日前向人力资源部递交考勤报表。3.1.2.8 参

14、与手工考勤的员工如有请假情况发生，应遵守相关请、休假制度，如实填报相关表单。3.1.2.9 外派员工在外派工作期间的考勤，需在外派公司打卡记录；如遇中途出差，持出差证明，出差期间的考勤在出差地所在公司打卡记录；3.2加班管理3.2.1 定义加班是指员工在节假日或公司规定的休息日仍照常工作的情况。A.现场管理人员和劳务人员的加班应严格控制，各部门应按月工时标准，合理安排工作班次。部门经理要严格审批员工排班表，保证员工有效工时达到要求。凡是达到月工时标准的，应扣减员工本人的存休或工资；对超出月工时标准的，应说明理由，报主管副总和人力资源部审批。B-因员工月薪工资中的补贴已包括延时工作补贴，所以延时

15、工作在4小时（不含）以下的，不再另计加班工资。因工作需要，一般员工延时工作4小时至8小时可申报加班半天，超过 8小时可申报加班1天。对主管（含）以上管理人员，一般情况下延时工作不计加班，因特殊情况经总经理以上领导批准的延时工作，可按以上标准计加班。3.2.2.2 员工加班应提前申请，事先填写加班申请表，因无法确定加班工时的，应在本次加班完成后3个工作日内补填加班申请表。加班申请表经部门经理同意，主管副总经理审核报总经理批准后有效。加班申请表必须事前当月内上报有效，如遇特殊情况，也必须在一周内上报至总经理批准。如未履行上述程序，视为乙方自愿加班。3.2.2.3 员工加班，也应按规定打卡，没有打卡

16、记录的加班，公司不予承认；有打卡记录但无公司总经理批准的加班，公司不予承认加班。3.2.2.4 原则上，参加公司组织的各种培训、集体活动不计加班。3.2.2.5 加班工资的补偿：员工在排班休息日的加班，可以以倒休形式安排补休。原则上，员工加班以倒休形式补休的，公司将根据工作需要统一安排在春节前后补休。加班可按1 : 1的比例冲抵病、事假。3.2.3加班的申请、审批、确认流程3.2.3.1 加班申请表在各部门文员处领取，加班统计周期为上月26日至本月25日。3.2.3.2 员工加班也要按规定打卡，没有打卡记录的加班，公司不予承认。各部门的考勤员（文员）负责加班申请表的保管及加班申报。员工加班应提

17、前申请，事先填写加班申请表加班前到部门考勤员（文员）处领取加班申请表，加班申请表经项目管理中心或部门经理同意，主管副总审核，总经理签字批准后有效。填写并履行完审批手续后交由部门考勤员（文员）保管。3.2.3.3 部门考勤员（文员）负责检查、复核确认考勤记录的真实有效性并在每月27日汇总交人力资源部，逾期未交的加班记录公司不予承认。下午 13 : 00 17 : 00度。全体员工都必须自觉遵守工作时间，实行不定时工作制的员工不必打卡。3.1.2.2 打卡次数：一日两次，即早上上班打卡一次，下午下班打卡一次。3.1.2.3 打卡时间：打卡时间为上班到岗时间和下班离岗时间；3.1.2.4 因公外出不

18、能打卡：因公外出不能打卡应填写外勤登记表，注明外出日期、事由、外勤起止时间。因公外出需事先申请，如因特殊情况不能事先申请，应在事毕到岗当日完成申请、审批手续，否则按旷工处理。因停电、卡钟（工卡）故障未打卡的员工，上班前、下班后要及时到部门考勤员处填写未打卡补签申请表，由直接主管签字证明当日的出勤状况，报部门经理、人力资源部批准后，月底由部门考勤员据此上报考勤。上述情况考勤由各部门或分公司和项目文员协助人力资源部进行管理。3.1.2.5 手工考勤制度3.1.2.6 手工考勤制申请：由于工作性质，员工无法正常打卡（如外围人员、出差），可由各部门提出人员名单，经主管副总批准后，报人力资源部审批备案。

19、3.1.2.7 参与手工考勤的员工，需由其主管部门的部门考勤员（文员）或部门指定人员进行考勤管理，并于每月 26日前向人力资源部递交考勤报表。3.1.2.8 参与手工考勤的员工如有请假情况发生，应遵守相关请、休假制度，如实填报相关表单。3.1.2.9 外派员工在外派工作期间的考勤，需在外派公司打卡记录；如遇中途出差，持出差证明，出差期间的考勤在出差地所在公司打卡记录；3.2加班管理3.2.1 定义加班是指员工在节假日或公司规定的休息日仍照常工作的情况。A.现场管理人员和劳务人员的加班应严格控制，各部门应按月工时标准，合理安排工作班次。部门经理要严格审批员工排班表，保证员工有效工时达到要求。凡是达到月工时标准的，应扣减员工本人的存休或工资；对超出月工时标准的，应说明理由，报主管副总和人力资源部审批。B-因员工月薪工资中的补贴已包括延时工作补贴，所以延时工作在4小时（不含）以下的，不再另计加班工资。因工作需要，一般员工延时工作4小时至8小时可申报加班半天，超过 8小时可申报加班1天。对主管（含）以上管理人员，一般情况下延时工作不计加班，因特殊情况经总经理以上领导批准的延时工作，可按以上标