FACSDiva操作说明资料讲解

1、FACSDiva操作说明书首先熟悉一下Diva的操作界面Q BO FACSDiv-d Soli.w-di«陆 Edl Vew EaioeN P问MomInsliuoerK MTS H«b应肝氐五瞬丽邕、EJivivwrTLfTTFTFjMane上1c一IM迩hflr £耐卵+： Un Gk*ol¥*ri：2hMl 占-赛 Specmsn.OGi *t TJw.C&l厂We I LaterIlTEEhrfdiff nr（尷咗傀i留罔皆i出豊|创二田|口|刖釦| 述1IAI丨I I丄TMH_(JD1DevIJs1 Afquhf 1IHKCCrd1St

2、O«W AJEveHi* |&H4 aNE* 阿Evflrfs ToRbCw®30000Everir Ta Dispioy1000 询二|2£jiq|因救通过点击菜单栏的相应的按钮，可以隐藏或展开相应的模块Browser三一三J Admlnlslraior=H| Simple AiWj sis 冒令 Insir Settings l+lGtotMl WorksheetsCdtwtfe Bezels回 画 叵i l»jFH-J Tufce_QQ-| l+ U Iutoc_002 *1 帀 Tube.003EF- jj Tufce_ao4Shared

3、 View12/11 ar.通过Browser，可以对数据库进行管理,Browser列出了文件夹、实验、及实验所包含的样本和管子。Acquisition con trol对获取和记录数据进行操作4口Instrument仪器设置这个框显仪器框显示了仪器连接状态，当打开一个实验，试管指向定位于一个试管时,示的是当前试管的仪器设置。5囚浏览框浏览框显示了worksheet或者Browser中选中的部件的属性，可进行修改。6_1worksheetIrrWiark sheet酉圍鲤|丛傀他问隆I斌险眩I曰口I巳问I、口AIL 11口血|圧|电 GiQb Sheetl Tube: Tutoe_001Pop

4、ulationEventsParent%Totai All Events30000100 0-pi28,81196.096.0 F26.39721.321.3Worksheet框，可进行画图、设门、设逻辑关系，进行统计等。7呵 Acquisition Status1T ue_001ThreohcW Rcrto:10000 cvt/sThreshoftd Couinti2063/1 ovtElectronic Abort Rste:Electronic： Abort (2匚untPror&s-sed Fvent'20570 wtFlApspri TirnR-oo：o o：n?.获

5、取状态显示了获取或记录数据时的状态。必须先新在基本熟悉Diva的界面后，下面就进行一个实验。在Diva软件上进行操作,建一个实验（实验必须建立在文件夹中）。下面描述的是如何使用这些命令：Creating a Folder and an Experiment这部分描述了如何创建一个Practice文件夹和包含有基础分析的实验。1在浏览框的菜单栏中单击IEl- PracticetKperment_UDlInMrOtobalYVockstieets2、重命名为 Practice，如下图 日 匚3 Administrator申 L J Practice3、选择Practice文件夹，点击浏览框菜单栏的

6、在文件夹下就创建了一个新的实验，这个实验包含了默认的仪器设置和一个空白的global worksheet o4、点及增加Specimen快捷键可加一个样本和试管。三 Experl ment_OWnA n instr SettingsIS Global Workslieets -声 Speciih&rijDOlU Tutoe_ooi5、 浏览框中点击左边的样本指向，指向tube-OO1。样本指向变成绿色，说明当前Exprime nt和Acquiziti on con trol中显示该tube的属性。6、 在Browser中选择每一项，看看Inspector框的变化。当tube-001被选

7、择时，在Inspector中可以看到有四个标签，分别点击看看变化。在这版软件中，一些仪器设置不能在Inspector中修改。当与流式细胞仪相连接时，可以在Instrument框中改变电压、域值和补偿。7、选择 Exprime nt Exprime nt Layout，对每个参数进行定义，如下图。当你的实验包含有很多试管时，你可以用Exprime nt Layout来一次标记所有试管。8、在Exprime nt Layout对话框中，点击 Acquisiti on标签，选择 Tube-001，改变计数粒子为 10000,点击 OK。当你在浏览框中选择Tube001时，在Inspector中的La

8、bels和Acqui中的选项也随着改变。9、在 Global worksheet 中创建一个FSC vs SSC 点图在worksheet菜单栏中点击1-11，再在worksheet中点击一下，就创建了一个默认大小点图。10、在FSC vs SSC点图中边上创建一个 PE直方图在worksheet菜单栏中点击直方图工具 L，再点击worksheet，一个默认大小的直方图就建立好了。点击X轴标签，在下拉菜单中选择PE-A，可改变图的参数。注意参数的名字是你先前设定的参数名。11在FSC vs SSC点图下面创建一个 FITC vs PerCP-Cy5.5的点图按住Ctrl键，点击FSC vs S

9、SC图的边缘，往下拖。当你拖的时候，就创建了一个复制 的点图。把点图放在合适的位置，松开鼠标，这个方法可以复制任何的点图。点击坐标轴， 选择合适的参数。12创建一个 Population HierarchyPopulation Hierarchy是用来列出定义的亚群。右击任何点图，选择 Show Population Hierarchy，把结果图拖到 FITC vs PerCP-Cy5.5点图的右侧。Worksheet应该看起来类似于下图：K-»low 1WFSC-A3pec.lfn«rib 口OJI-Tubt ICD 4 FITC：-A'I n r 1 1 I 1

10、 ZOO3WSioe亡l«Ti右憎 001-Tube 0011W4W*1UaCD-IS*56 PE-ATube: Tu&b_C)01H opulabanW-Farenl 'hiatal jAII EvenlaOExporting an Experiment as a Template现在已经创建好一个实验了，可以导出成为一个模板。实验模板包括了样本、试管、关键词、仪器设置、标签、worksheet上的图以及 worksheets （包括所有设置，如分页），但不包含有数据。一个实验可以保存为一个模板，为了简化浏览框，模板不通过浏览框选择。1、在浏览框中选择 Exprim

11、e nt-OO1，再选择 File Export Exprime nt Template。确定选择的是 Exprime nt Template 命令，而不是 Exprime nt 命令。Export Experime nt Template Wizard出现，对话框上的黑体字告诉你每个框的作用2在模板类型中输入 Practice，模板名字中输入Simple Analysis。模板类型用来对类似的模板进行分组，以便于查找。当你在创建一个模板时， 至少要输入类型和名字，后面的选项是可选项。3点击Next，可查看后面的选项，点击Finish。Creating an Experiment from a

12、 Template现在可以用原来保存的模板来创建一个实验。记住当你想在一个文件夹中创建一个实验时，首先要选择文件夹。1、选择 Practice文件夹，选择 Experiment New Experiment。当你想用原来保存的Exprement模板时，使用菜单栏而不是快捷键，你也可以按Ctrl-E。Experime nt Templates 对话框出现2、在对话框中，点击Practice标签，选择 Simple Analysis template，点击键。Experime ntLayout对话框出现，显示试管标记、关键词、模板的设置等。3点击Experiment Layout对话框中的各种标签

13、，查看设置，然后点击Cancle。这些设置是你建立模板时设定的，注意：这些数据是只读的，不能修改。4点击0K建立一个新的实验注意原先的实验已经关闭，一个新的实验Simple Analysis在浏览框中。当你在做实验时,一次只能打开一个实验。I+： E Experimarrt.QOISimps Analysis_0O1gw Instr Settings+I-® Global WorksheetsElSpecimen_001LJ Tube_001注意global worksheet中包含有点图和 Population Hierarchy，在点图中没有数据。Importing an Exp

14、eriment接下来，你将在Practice文件夹中导入一个实验。导入实验与导入模板的不同之处在于 它们包含有记录的数据。1 选择 Practice文件夹，选择 File Import Expriments默认情况下，当导入一个实验时，D:BDExportExperiment folder将会出现，除非你以前 改变路径导向到另一个文件夹。2、选择命名为 Manual Comp的文件夹，点击Import。Exprime nt导入的实验都是以文件夹形式出现，文件夹在导入后在浏览框中将会以实验 出现。注意原先的实验没有关闭，新的实验加在Simple Analysis Experiment后面Prac

15、tice* Q Experiinent_001-|= Siinple AnalysisS0 Irstr Settings1+ » Global Worksheetsiri- 5pecinneri_00lC Tube_001+ H Manual Comp有三种方法在浏览框中增加实验：1用浏览框工具栏中的快捷键一1来新建一个空的实验(默认条件设置)。2、Exprime nt New Exprime nt命令新建一个新的实验，实验来自于一个原来保存的模板， 模版包含下列部分：点图、门、统计图和仪器设置。3、File import Exprime nt命令，可新建一个实验，通过这个方法获得的

16、实验包括原来保 存的实验条件等和数据。Working with Experiments in the Browser现在在浏览框中有三个实验，一个关闭的实验(Experime nt_OO1), 个打开的实验模板(Simple Analysis)和一个关闭的导入的实验(Manual Comp)。接下来的练习来证明关闭和打开的实验之间的不同，以及如何来比较仪器设置。1 点击Manual Comp Experiment前面的(+)，展开实验。尽管在browser框中显示出实验组分，但点图依旧是空白的，你必须打开一个实验来获 得它的数据。注意：展开一个实验和双击打开一个实验是不同的 Manual Co

17、mp1Instr Settings1±豊 Global Worksheets i+声 Comperisation Specimeri F 声 Calibrita-|= simple Analysis IS Instr SettingsFtl-Global Work$hset$iksiaec men_ooiU TubjClCM2、双击 Manual Comp Experiment 来打开Simple Analysis Experiment 关闭，在worksheet 中显示 Manual Comp Experiment 中的分析目标。3、点击其中一个实验样本Manual Comp Ex

18、periment中，在每个样本下面含有多个试管，注意每个试管都是绿色的，说明每个试管都包含有数据。4、点击试管指示到任何一个试管。自13 Manual Comp姦导 instr SettingsOlotnal WorkchiQiQtcli-画 Glctol Sha&tlli 務 Compen&atlor Gp&ckmsrli 爵 Calitorita 申富Pre SortE H Far Left Post Sort口 頁& 何itaht RoE Sortmi :白 .真 Left Post BoirtFT |J Far Riaht Post Sort在globa

19、l worksheet中包含有点图、 试管中含有数据，数据就显示在worksheet中，可用试管指示来定位试管，则将显示所选择试管的数据。5、在browser中选择其它试管注意：数据并没有改变，必须依靠试管指示，才能在global worksheet中显示其他试管的数据。 尝试把试管指示指向另一个试管，注意数据的变化。6、展开 Simple An alysis Experime nt，选择 In str Sett ings。注意Inspector上的仪器设置是所选Instru settings的设置，尽管实验已经关闭。7点击Instrumengt框中的各个参数Instrment框显示了试管指示

20、所对应的试管的仪器设置(Manual Comp Experiment中的tube)。In spector显示的是试管的设置或者是所选择的 In str Sett ings的设置。在这个例子里，In spector 显示的是Simple Analysis Experiment实验的仪器设置，你可以用 Instrument框和Inspector来比 较浏览器中的任何两个仪器设置。普jblUlE | 岂|«|jTrJb&_EC1uNem2£jAdmhiSirSlOrfe-Pradic* *Ej>trlmetirt_OQ1 |l;4E 名爲"*忖血_001h

21、itr Setting鼻一简 GbbdWMksfiects ffi 护 £pBcmen_OCH S-|I) Manual 匚mp.DOI5 hsir SeritinsSialus念 | Thr«ncJd | Ccmpensetion | Rrto LnsorPerimeter|a|h|.厂FL厂上J| - |ssc240LI?厂厂| |fitc4 2Dprrr te-40117皇颁f*prr1 rBODLJPJfsehSfrimvrll CoEScted显示的是ManualComp_001 中 PE 试管的仪器设置E (ETwiplBteampensaikin Spechw

22、 iftfflf別«沾畀 LkiTtHrrvd Cortroi . II n AdarIn sir显示的是simpleFire窗*轉瑕口呻 RE Sinned ConBrol.PerCP-CvSS Slant . APC SlfirrtdB匡一皆 CaibnioPw HEVtBTMP-bi ameteiFwamrtcirlpo-VottBorShewed View0 0-0-00rFRRR_lAn alysis_001的Settings的仪器设置in struUsing Gating Features在 BD FACSDiva 软件中：可以创建四种类型的门：polygon、recta

23、 ngle、quadra nt 和 in terval。 自动圈门工具Automatic和Snap-To门工具可用来设置 polygon和interval门。 在这一节中，你需要先前所建立的Simple Analysis 和Manual Comp实验。Creati ng Gates这部分说明了在 Manual Comp Experiment中怎么用worksheet中的菜单栏来设不同的门:1、打开 Manual Comp Experiment2、把试管指向对准 Calibrite样本下的Pre Sort试管，如下图：4、试管指示指向下一个试管，可以看到一些粒子在门外。5、选择 FSC vs S

24、SC图的 Autopolygon 门，Delete按Delete键而不是Backspace键，如果Delete键不工作的话，右击门，选择 delete。这将会 激活Delete键，下次就可以使用。6、在 FSC vs SSC点图上创建 Snap-To polygon门门Calibrlte-Far Right Post Sortfio 100200250Snap-To polygon 禾口 autopolygon 门不同，Snap-To polygon 门自动重新计算。可看见 Snap-To polygon门的边框比较粗。7、把试管指示回到Pre Sort试管，注意门的变化。8、（可选）用其它设

25、门工具进行练习,在点图上去除Snap-To0，创建一个 Rectangle门门）和一个Polygon门（口）Edit ing Gates这部分描述怎样移动和改变门的大小1选中FSC vs SSC点图上的门，在每个顶点上会出现一个把手。2、移动选中的门移动门的时候，选择门的边，而不是顶点，可看到门的标签随着门一起移动3、拖动其中的一个把手来改变门的大小在你移动或者改变Snap-To门时，门将不会自动调准。你可以通过右击门的边，选择下 拉菜单中的重新计算。4、通过拖动门内的标签，可把标签拖到门外5、在门外点击，释放门6、关闭 Manual Comp Experiment.Subsetting Po

26、pulationsSimple An alysis Exprime nt 包括三个点图和一个 Populati on Hierarchy 。 Populati onHierarchy主要是用来查看各个门内群体关系。在这里，你需要原来创建的Simple Analysis Experiment，在软件安装时，样本文件存在于 BDExport'FCS 文件中。导入数据在你进行分群前，需要含有数据的点图：1、通过双击来打开 Simple An alysis Exprime nt ,只有把实验打开时，你才能导入数据。2、选择 File Import FCSfiles通常，D:BDExportFC

27、S文件出现，除非你原来改变过路径3、双击4色文件，在双击 Calibrite beads文件夹来打开。4、选择文件中所有的FCS文件，点击ImportU Import FCS filesLook in.j Calibrite beadsTube.OOi ,tcsTube_0O2.fcsTube 0O3,tcsLJ Tube_0O4.fcsFile name:Tube 001.fcsFiles of type;|AIIFile? (*,*>JCancelImport当导入FCS文件时，需要选择文件，而不是文件夹，可以通过Shift和Ctrl键来选择多个甚至全部。这样就增加了一个新的样本Ca

28、librite Beads，含有四个带数据的试管。Tube-0015、在Calibrite beads样本中，把试管指向Srople Analysis_OOl S Instr Settings + ® Global Worksheets -一店 SpecirinOOl *U Tube_001-Calibrite0 0SImD Tube_001TutoejJOjT <jbe_003Tube 0046、在浏览框中选择 Tube-001，勾选Inspector中荧光参数前的 Log Checkbox 。 InspectorTube Labels Acq. | Keywords ins

29、tr. Settingsj| Parameters Compensation)Parameter-ParameterTypeLog Voltage厂厂EEEE0 1 7 0 0 90 3 5 2 8 82 3 4 4 5 5HA A A A AAITCEF pPrint7、对Calibrite Specimen实验的其它试管做相同的操作Defining and Subsetting Populations1、Tube-001 的 FSC vs SSC点图上，建立一个 Autopolygon 门。Calibrite Beads-Tube 001so too iso aa 2M(161229. 1

30、10540)FSC-A“观新的P1群就在Population Hierarchy上出现。2、把标签P1拖出Autopolygon gate （点中P1标签，拖出门外）。3、建立一个只显示P1群的PE直方图右击直方图，选择show population P1。在直方图上只显示 P1群体，注意到直方图上所有 的点都是红色的，是 P1的颜色。1-曰s-u 矿S-口r=okS-llmDoTube: Tube.OOlPopulationEvents % Parent 琨 Total All Events -pi30b0002S.811«6.Di oao96.0("I)4、PE直方图上

31、，在 PE阴性峰上创建一个 Autointerval门Population Hierarchy图上P2群显示在P1群下面。当你在一个群下创建一个门，新的群体 是原来群体的一个亚群。Calibrite Beads-Tube 001FAI-i-?-g-cmuTube- Tube_001Population#E ventsParent%TotalM All Events30.000100.0Pi2e,aii96.096.0>0P225.009S6.8B3.4注意到P2旁边的颜色框是一个十字叉，说明子群的颜色仍旧是其母群的颜色。默认情 况下，In terval和Quadra nt门定义的群体一般

32、不会被授予颜色。5、点击FITC vs PerCP-Cy5.5点图，显示 P2群体在点图上右击，选择 show population P2点图是空白的，因为 P2群体没有颜色，下面是给 P2群体设置一个颜色：1）双击Population Hierarchy前的颜色框2）选择一个颜色6、在 FITC vs PerCP-Cy5.5 点图上建一个 FITC 阳性的 Rectangle门。扩展门的边越过X轴，可以包含有轴的粒子。因为点图显示的是 P2的群体，新的P3群体是P2群体的一个子集。TubeOOlcahbrite Beaas-Tube 001Tube:Population All Events

33、P2lF3#Even1s %Parent%Total30.0001100 028.81196.D96.025.009S6.g83.46.29325.221.0FITZ下面的步骤显示另一种建群体的方法。7、设置FITC vs PerCP-Cy5-5点图显示全部的粒子Tip你也可以用Inspector来显示一个点图的群体层次结构。8、 Population Hierarchy 中选择 P2群体，在 PerCP-Cy5.5 阳性群体上画一个 Autopolygon 门。结 果如下，可以看出新创建的P4群体是P2群体的一个子集。Ca ibme Beads-Tube 001Tube: Tube OiOl

34、Population All Events-Hpi P2#Evenis% Pa rent%Total30,00010C.028,81196.0gc o25,00966.803.46,29325.221 05,78423119.3在进行分群时为了避免错误，保持Population Hierarchy可视。在你改变群体的名字或者颜色时，你还是可以选择群体。Gating Multicolor Experimentsin terval 禾口 quadra nt 门的特下面的教程说明了在用人外周血进行淋巴细胞亚群分析时, 性。在这个实验中，细胞用 CD3 FITC, CD16+CD56 PE, CD45

35、 PerCP-Cy5.5, CD4 PE-Cy7, CD19 APC,和 CD8 APC-Cy7 进行染色进行这一步学习，您需要6-color Experiment ( BDExport'Experiment folder )。1、在 Practice folder.中，导入 6-Color gating选择文件夹，选择 File > Import > Experiments，在 BDExport'Experiment folder 中定位6-color gating。选择文件，点击导入。2、双击实验，打开实验3/16+56/45/4/19/8 试管，如下图。3、展

36、开lymphocytes样本，试管指向定位在B-cotor gating hstr Saltings + 亘 Gtob引 Worksheets Lymphocytes*3/16+56M5Mn 9/8在worksheet点图中就会显示数据4、在CD45 vs SSC点图上，单核细胞和粒细胞上画一个Rectangle门。Tip :把门延伸过点图的轴，这样就包含在轴上的点。6+5 &f 5/19/8CD45 FerCP-Cy5-5-A5、在 Population Hierarchy 中把门命名为 MNEs ( monocytes、neutrophils、eosinophils )，选 择P1

37、，输入 MNEs，enter。茨:矢金4<ococo101D0I60209260FSC-H0 I AM)8、在淋巴细胞上画一个Autopolygo n gate (），在Population Hierarchy上把这个群体命名为Tube： 3/16+56/45/1 WPopulation#E ventsParent%TotalI All Events10,000100.0HMNEs4,47344.744.76、在 Population Hierarchy 图中右击 MNEs，选择 Invert Gate。在Population Hierarchy图上就增加了一个新的群体（不包含单核细胞、

38、粒细胞和嗜曙红 细胞）。Tube： 3/16+56/45/4/1W%Prent簧 TotalPopulaNonEvents All Events10,000100.0 MNES4,47344.7447 NOT(MNEs)5,62755.35537、右击FSC vs SSC点图，选择显示 population NoT（ MNEs ），结果如下图。I* | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | n50 1OD 150 2OD 250FSC-H孙测；Ilymphocyte，结果如下图，淋巴细胞是 NOT MNEs的一个子集。Lwonocvles-3ri 6+

39、5&r<5f4ji 蜩S-Tube. 3/10*5E/Jl5W19PopuUlion#E¥&nfl.s %Parenl %Total All Events10.000100.Q mnes0.31063.163.1 NQTWNEs)3.S9D3E.936.9 Lymphocvtea3.W50 IUD l» 2HD RDIden tify ing Lymphocyte Subsets下面就把淋巴细胞分为 T、B和NK细胞。1右击FSC vs SSC点图上的淋巴细胞门，选择Drill down。一个新的FSC vs SSC图出现，只显示淋巴细胞。在一张点图上

40、定义了一个门后，通过Drill down就可以创建一个只显示门内群体的点图。2、在新的点图上，把 FSC换成CD3。3、在CD3+细胞上画一个Interval gate （一般应用在直方图上，在点图上也适用），命名新的 群体叫做T细胞。Tube： 3/16+66/46/4/1 fl/SPopulationEvents % Pa rent 9tTotai Ail Events10.000100.0 MNEs6.31063 163.1 NOT(blNEs)3.69036.936 9 Lymphocytes3,38891 333.9cells1.82553.918.24、 用类似的方法可以得到B、N

41、K亚群5、按住 Ctrl 键，在 Population Hierarchy 中选择 T、B和NK ,右击，选择 Join Gates,在PopulationHierarchy图上就出现一个新的群体，是T、B、NK细胞的总合。Tube： 3/1 6 + 56/45M/1 9/0Populaiion#E vents%Psrent%Total All E/HriLb1 0,0001 00.0 MNEs6,31 063.163.1口 MQT(MNEs)3,63036.936.91 I 1 ymphnnytRS91 .B33.9卤 T cells1 日 2553.91 8.2凶 B CCIIG1 885

42、.51.9 NK ubill!=：1 ,23736.51 2.4I- T Chilli OR B wllw OR Nk：3.25095.932.5Calculat ing Compe nsati on Using In strume nt SetupBD FACSDiva软件可以自动的计算光谱的重叠值，在进行补偿时，更加节约时间，更 加精确。下面介绍如何使用In strume nt Setup feature。Setti ng Up Compe nsati on Con trols1 打开 Experiment_0012、编辑参数如果计算机与仪器相连，打开Specimen-001，把试管指针指

43、向Tube-001，在Instrument框中编辑参数。如果脱机操作，选择 Exprime nt下的in strume nt sett ing，在In spector中编辑参数。3选择 Instrument-lnstrument setup-Create compensation controls 。下面的对话框将出现Q Erie-ate- C«3mpen5-aliion 匚 oimtrolsTtihE's 厂匡 ijride seftaFirte urtslahned poriird tub型莎创iAddOK1C«w$i4增加或者删除对照，定义标记特异性对照，或者

44、可以改变补偿控制的顺序。5点击OK6展开 Compensation Control specimen 来查看补偿对照。-ExperimentJOOl|卜!令 Instr SettingsB Global WorksheetsSpecimen_001FE Stained ControlCD45 PerCP-Cy5*5 Stained ControlCD4 PE-Cy7 Stained ControlCDB APC-Cy7 Stahed ControlAPC Stained ControlCompensation Controls Instr Settings Jnstain&d Cont

45、rol FITC Stained ControlCreating an Instrument Configuration在In strume nt Setup中，下一步就是记录数据。 为了计算补偿，首先要把in strume nt con figuration 设置成符合记录数据的格式。1 选择 Instrument-lnstrument Configuration2在 Instrument Configuration 对话框中，选择 Add Configuration3在 Instrument Configuration 对话框中，输入 2 laser, 4 color，点击 OK注意：确认

46、你输入的名字完全与图上的相符，如果字符的空格或者大小写与例子不符，在计算补偿时，就会有一个错误信息。4在instrument configurations 歹U表中，选择 2 laser，4 color，点击 Add Parameter键6次 instrument configuration 图应该如下所示：5命名laser和detector，输入每个参数的名字首先应该确定一个Detector,再改变参数的名字。可以通过查看其他的 configuration来找到每 个参数合适的laser和 detector。通过相应column的下拉菜单来选择所对应的设置，把参数的名字改为FSC、SSC、F

47、ITC、PE、PerCP 和 APC。6点击okImporting Data and Calculating Compensation现在已经设置好与我们试验相符的confuguration ,接下来就是导入数据。可以用原来记录的数据(Sample exprime nt)来计算补偿1 选择 Practice folder ，从 BDExport'experime nt folder 里导入 AutoComp Exprime nt 。选择 File- Import- Experime nt，找至 U AutoComp Exprime nt 文件夹，点击 Import。2双击 AutoCo

48、mp Experiment 打开实验这个实验包含有一个 Compesation Specimen和四个荧光参数的试管3双击 Unstained Control Tube，打开对应的 worksheet4在FSC vs SSC点图上，移动P1门包含所有的阴性粒子P1Unstained ControlI n | I I I I | I I r i J I I i n J I n I I J r50100150200250FSC-A0*00)s-g-g-?-3-5 右击门的边框，选择 Apply to All Compe nsation Con trol 。6 双击第一个 Stained Contr

49、ol Tube ( FITC Stained Control )，在 worksheet打开相应的点图。7确定P2门包含了所有的阳性颗粒。P2门是一个Snap-To Interval门，已经包含了所有的阳性颗粒。如果一些颗粒在门外，右击门，选择 recalculate oFITC StminEd ControlI I | | u I | | | | v | I I i i | r 100150200250FSC-ACk 1 .MO)8双击下一个 Stained control tube，打开相应的 worksheet。9对下面的试管，重复7和8，当所有的门设定好后，你可以进行补偿计算了。10选

50、择 Instrument-Instrument setup-Calculate Compesation 。将会出现一个对话框，可以进行命名。11对于新的补偿进行命名，点击ok。一个新的设定，包括了参数和标记信息,阈值和电压，计算好的补偿。新的仪器设置储存在Setup catalog 下。Calculating Compensation Manually在进行下面实验时，需要导入Manual Comp Experiment，进行手动补偿时不需要链接仪器。Adjusting FITC Compensation这部分描述了怎样计算 FITC荧光的溢出，其他荧光也是类似的。1 选中 Compensat

51、ion Controls Specimen 样本下的 FITC Stained Control 管。Manual Camp 舲 Irstr SettingsGlobal Vfcrksheets回画叵回画Compensation Controls 冷 Instr SettingsI Litistairieti ConlrolE3- t FITC Stained Corltroi0 PE Stairked Control H PerCP-C55 Staireci Canlroli7 I iyi rl I "|'| T il l | V 1 f'l'l IT I 1

52、 I 50100150i200250FSC-A QgfOl+l j APC Stained Control2在FSC vs SSC点图上创建一个 Snap-To gate，如下图SH own® 器P13在worksheet上选择 FSC vs SSC点图，右击点图，选择 Show Populations > P1。4在 FITC-A vs PE-A 点图上，画一个 FITC 阳性的 Interval gate。在 Population Hierarchy view 图 上，进行重命名为 FITC Positive。5 在 Population Hierarchy view 图上

53、右击 FITC Positive，选择 In vert Gate，重命名为 NOT (FITC Positive) population Negative，女口下图7 口一J 一.D” YFITC/PositivsL LTT<djCompen牟aticm Control-FITC w2 io° ioA 10sTube: FITC Stained ControlPopulaticnEvents%Parent%Total All Events5,0001000 P14.S32926926因 FFTC Positive1.S4837.0370 NOT(FITC Positive3.152630630FITC-A6在Inspector框中显示补