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1、虎杖甙对炎症状态下多形核白细胞趋化活性调节的机制研究黄海潇1(3252000025) 赵清1(3252000064 ) 指导老师：金春华2(1.学员一旅十三队临床本 广州510515 2.南方医科大学基础医学院实验教学中心广州510515)摘要：目的：初步研究虎杖甙对内毒素刺激下白细胞趋化活性调节的机制。方法：观察虎杖甙对LPS刺激下白细胞上清对白细胞趋化活性的影响及PD对LPS刺激下FPRL1/293趋化活性的影响。结果：LPS也可增加PMN趋化因子的分泌，PD可以下调PMN对LPS刺激后PMN悬液上清趋化性的升高。PD同样可以下调LPS刺激下转染了甲酰化肽样受体基因的细胞株的细胞趋化性的升

2、高。结论：PD可以通过抑制白细胞趋化因子的分泌和下调甲酰化肽样受体活性下调白细胞的趋化活性，进而发挥抗感染性休克的作用。关键词：虎杖甙；趋化作用；内毒素；甲酰化肽样受体；多形核白细胞Role of polydatin in the chemotaxis of polymorphonuclear leukocytesunder the stimulation of LPSAbstract: Objective To understand the action mechanisms of polydatin (PD) in the regulation of polymorphonuclear l

3、eukocytes (PMN) chemotaxis under the stimulation of LPS. Method Chemotaxis assay was used to investigate the regulative role of formyl peptide receptor like-1 in the chemotaxis of PMNs in response to PD and LPS. Results LPS could increase the secretion of PMN chemotactic factor and up-regulate the f

4、unction of formyl peptide receptor like-1. PD did not obviously affect the normal secretion of PMN chemotactic factor and the function of formyl peptide receptor like -1, but it could significantly reduce the rise of the excretion of PMN chemotactic factor caused by LPS stipulation and up-regulate P

5、MN formyl peptide receptor expression. Conclusion PD can regulate PMN chemotaxis by down-regulate the secretion of chemokine and the function of FPRL1 and may play a crucial role in the treatment of inflammation.Key words: polydatin; chemotaxis; LPS; formyl peptide receptor like-1; polymorpho- nucle

6、ar leukocytes近年来在对革兰氏阴性(G-)菌引起中毒性休克的机制研究中，认识到内毒素(endotoxin，LPS)引起休克、造成多器官功能衰竭(MOF)的机理并非由细菌感染直接作用,而是宿主受LPS刺激后体内释放多种内源性细胞因子引起的过度炎症反应的结果1。虎杖甙（Polydatin,PD）是从具有清热解毒、凉血行淤功能和抗病毒、抗菌作用的中药虎杖中提取的主要成份，对烧伤性、感染性和失血性休克有良好疗效。近来的工作证实2PD在炎症状态下对细胞趋化性的调节可以使炎症反应和抗炎症反应趋于平衡。但其调节细胞趋化性的具体机制尚不明确，为了进一步探讨PD的作用机理，我们用趋化性分析的技术观察

7、了PD对正常及LPS刺激下白细胞分泌趋化因子及白细胞膜上甲酰化肽受体异构体（formyl peptide receptor like-1）活性的影响。1 材料与方法1.1材料：1.1. 1主要试剂与仪器：fMLP、LPS 购自Sigma公司；DMEM、RPMI-1640为美国GIBCO产品；小牛血清为杭州四季青公司产品。PD由深圳海王制药公司提取；牛血清白蛋白购自上海伯奥生物科技有限公司；糖原购自中国医药集团上海化学试剂公司； 其余为国产分析纯产品。趋化实验装置和趋化膜购自NeuroProbe公司，由美国王吉明博士提供。1.1.2 稳定表达FPRL1的293细胞株（FPRL1/293）由美国王

8、吉明博士提供。1.1.3 趋化缓冲液（binding medium, BM）: 含终浓度为1%BSA、30mmol/L HEPES、20mmol/L Glutamine、200units/L Penicillin和200g/L Streptomycin的RPMI-1640。1.1.4 实验动物: SD大鼠，体重180200g，清洁级，由第一军医大学实验动物中心提供。1.2 中性粒细胞的制备：用糖原生理盐水腹腔注射的办法分离PMN3。1.3 PMN悬液上清的制备：获得的PMN以趋化缓冲液重悬，分为5组进行处理：1）不进行任何处理；2）按所需终浓度加入1mg/ml的LPS处理30分钟；3）在30分

9、钟后按所需终浓度加入8mg/ml的PD孵育30分钟；4）先按所需终浓度加入1mg/ml的LPS，30分钟后按所需终浓度加入8mg/ml的PD孵育30分钟。处理后分别以2500rpm离心5分钟，取上清，细胞再以趋化缓冲液重悬，调整细胞浓度为2×106/L备用。1.4PD对LPS刺激下PMN分泌趋化性细胞因子的影响趋化性的检测及实验分组：1.4.1 细胞趋化性的检测：趋化活性的检测方法用趋化小室法4。1.4.2 实验分组：（1）空白对照组：下孔为单纯的趋化缓冲液；（2）阴性对照组：下孔为未加任何刺激的PMN悬液上清；（3）LPS刺激组：下孔分别为终浓度10、100、1000ng/ml L

10、PS处理30分钟后PMN悬液上清；（4）PD处理组：下孔分别为不同终浓度PD处理30分钟后PMN悬液上清；（5）PD治疗组：下孔为LPS孵育30分钟后再以PD处理30分钟后PMN悬液上清。1.5细胞甲酰化肽样受体FPRL1对细胞趋化性的影响的趋化性检测及实验分组：实验分为4组，除空白对照组下层为单纯趋化缓冲液外，其余各组下层小孔内均为浓度为10-7mol/L的fMLP，具体分组如下：（1）空白对照组：趋化小室上层为293或FPRL1/293细胞；（2）正常组：趋化小室上层为未做任何处理的293或FPRL1/293细胞；（3）LPS组：上层为100ng/ml LPS刺激30分钟的293或FPRL

11、1/293细胞；（4）PD组：上层为在LPS刺激组基础上又以0.08mg/ml PD处理30分钟的293或FPRL1/293细胞；1.5 统计方法：结果用平均数±标准差表示，应用SPSS 10.0统计软件进行多组均数之间的单向方差分析，方差齐性时使用SNK法，方差不齐时采用Dunnett´s C方法，P<0.05为具有统计学意义。应用Microsoft Excel进行图表处理。2 实验结果21 不同浓度LPS刺激及PD治疗后PMN悬液上清对PMN趋化性的影响：实验结果显示（图1），当上层细胞为正常PMN时，阴性对照组对PMN的趋化指数与空白对照组基本一致（趋化指数分别

12、为1.20±0.47 vs 1.00，P>0.05）；在LPS刺激后PMN悬液的上清对PMN的趋化指数较阴性对照组有明显增加，当LPS浓度分别为10ng/ml，100ng/ml和1000ng/ml时,白细胞趋化指数各为5.86±2.42，8.30±3.28和7.65±2.35，LPS刺激组显著高于阴性对照组(P<0.05)。而在LPS刺激后再以PD作用，则可以明显下调由LPS刺激产生的趋化性的增高，其趋化指数分别降为：1.69±0.55，2.49±0.84，3.15±1.01，分别与加药前相比均有显著性差异（P&

13、lt;0.05）。*Fig 1.Effect of the culture supernatants of PMN under the different doses of LPS stimulation and PD treatment on PMN chemotactic indexThe concentration of PD is 0.08 mg/ml, 0, 10, 100 and 1000 ng/ml are concentrations of LPS.* P<0.05 vs control ; P<0.05 vs LPS group respectively. n=9

14、.图1 不同浓度LPS刺激后及PD治疗后PMN悬液上清对PMN趋化性的影响注： 10、100、1000 ng/ml为LPS浓度。* 表示与阴性对照组相比P<0.05，表示分别与LPS刺激组相比P<0.05。n=922 不同浓度PD刺激PMN悬液上清对PMN趋化性的影响实验结果显示（表1），经PD处理过的正常PMN上清（下孔分别为0.8、0.08、0.008mg/ml PD处理30分钟后PMN悬液上清）对PMN的趋化活性没有明显改变.(P>0.05)Tab 1.Effect of the culture supernatants of PMN under the differe

15、nt doses of PD treatment on PMN chemotactic index (n=9)表1. 不同浓度PD刺激PMN悬液上清对PMN趋化性的影响（n=9）趋化指数空白对照阴性对照PD处理组0.008mg/ml0.08 mg/ml0.8 mg/ml均值1.001.201.191.171.54标准差0.470.780.570.732.3 不同浓度PD与LPS共同作用下PMN悬液上清对PMN趋化性的影响：实验中LPS刺激组趋化小室下孔为100 ng/ml LPS处理30分钟后PMN悬液上清；PD治疗组下孔为在LPS刺激组基础上再分别以0.8、0.08、0.008mg/ml P

16、D处理30分钟后PMN悬液上清。结果发现（图2），当被趋化的细胞为正常PMN时，PD在0.8mg/ml到0.08mg/ml范围内均能抑制LPS刺激后PMN悬液上清对PMN的趋化作用，以PD浓度0.08mg/ml时效果最显著，其趋化指数可达2.49±0.84。而0.008mg/ml的PD的作用则不显著。而与阴性对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。*Fig 2.Effect of the culture supernatants of PMN under LPS stimulation and the different doses of PD treatment on PM

17、N chemotactic index.All group except blank and control were treated with 100ng/ml LPS, 0.8,0.08 and 0.008 were concentrations of PD. * P<0.05 vs control group; P<0.05 vs LPS group. n=9.图2 不同浓度PD与LPS共同作用下PMN悬液上清对PMN趋化性的影响注： 0.8、0.08、0.008mg/ml为PD的浓度。* 表示与阴性对照组相比P<0.05，表示与LPS组相比P<0.05，表示与P

18、D治疗组2相比P<0.05。n=924 PD、LPS刺激后PMN悬液上清对PD、LPS刺激后PMN趋化性的影响：实验结果（表2）显示，下孔为LPS刺激组上清和PD治疗组上清的细胞趋化性与空白对照相比明显升高(P<0,05)，而下孔为空白对照和PD作用组的上清与空白对照相比无明显差异（P>0.05）。Tab. 2 Effect of PD, LPS on the chemotaxis of PMN under PD, LPS treatment表2. 不同浓度PD刺激PMN悬液上清对PMN趋化性的影响（n=9）upperblankPDLPSLPS+PDlowerblank12&

19、#177;3 12±413±515±5PD13±415±415±517±7LPS90±14 *86±20 *127±15 *70±14 *LPS+PD27±7 *18±7 *103±17 *26±9 *: P<0.05 vs upper and lower both blank group. n=9。2.5 细胞甲酰化肽样受体FPRL1对细胞趋化性的影响实验结果显示（图3）：野生型293本身并不表达趋化性受体，它在各种刺激下趋化指数基本没有

20、变化，与空白对照组一致（P>0.05）。而转染了FPRL1受体的293细胞在趋化因子的影响下，其趋化指数达到了4.01±0.99，与空白对照组相比有了明显升高(P<0.05)。而在LPS的刺激下，其趋化指数进一步升高至8.00±2.57，较正常对照组有明显升高（P<0.05）。在LPS刺激后加入PD处理，则发现升高的趋化指数明显下降（P<0.05），为4.42±1.67。PD治疗组的趋化指数与正常对照组相比没有明显变化（P>0.05）。*Fig.3 Effect of PD on FPRL1/293 chemotactic index

21、 under stimulation of LPS*P<0.05 vs blank group; P<0.05 vs normal group; P<0.05 vs LPS group. n=9图3 PD对LPS刺激下FPRL1/293细胞趋化性的影响注：*表示正常对照组与空白对照组相比P<0.05,表示与正常对照组相比P<0.05，表示与LPS刺激组相比P<0.05。n=9。3 讨论：感染性休克代表了宿主对全身性炎症的病理生理反应。 LPS作为诱发全身性炎症反应的两类诱导剂之一，可以通过多种膜表面受体激活PMN趋化、聚集、游走到炎症部位，释放各种活性酶和白

22、细胞三烯B4（LTB4）等，引起炎症反应，造成组织细胞损伤5。近几年研究阐明了炎症期间白细胞滚动、粘附、游走，并发挥其功能是造成炎症损伤的主要机制6，7。该机制的关键步骤是趋化因子对白细胞激活信号系统的启动,包括不同趋化因子与受体结合出现的一系列生化反应过程。趋化因子是白细胞外渗和组织浸润的重要媒介。炎症细胞可以和多种趋化因子反应而引起细胞移动、整合素活化、超氧阴离子产生和脱颗粒反应。这些功能组成了对抗微生物入侵的第一条防线。到目前为止，很多种趋化因子已经被分离纯化出来，包括“经典的”趋化因子，包括细菌甲酰化肽甲酰基甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸（fMLP），活化的补体5（C5a），白细胞三烯B4

23、（leukotriene B4, LTB4）和血小板活化因子（platelet activating factor, PAF）以及新定义的趋化因子总科。体外实验表明，许多物质可以刺激白细胞及非白细胞产生这些趋化细胞因子，在诱导物的刺激下，趋化细胞因子mRNA水平在短时间内可明显升高8,9。其趋化白细胞的机制是通过特殊的信号传递系统，激活白细胞表面的粘附分子(cell adhesion molecule,CAM)，后者与血管内皮细胞的相互作用促使白细胞游向炎症区域，使白细胞、吞噬细胞、单核细胞脱颗粒并释放某些酶产物发挥其效应。趋化因子受体与三磷酸鸟苷蛋白(G蛋白)形成的耦合体，不同组织及器官的趋

24、化因子受体类型及分布数量各异，其性质及量决定与趋化因子结合后所起的生物学作用 9。在本实验中, 我们利用LPS刺激动物细胞模拟感染、炎症条件，以fMLP为趋化因子来研究PD对白细胞趋化性的影响。LPS刺激后的PMN悬液上清表现出了明显的趋化活性。我们推测可能是由于LPS激活PMN后，使PMN分泌了一些趋化性的细胞因子，从而使PMN的趋化性增加。PD作用后PMN悬液上清对细胞的趋化活性并没有明显改变，但PD可以明显降低由LPS刺激引起的PMN悬液上清对细胞趋化活性的增高。因此我们考虑，LPS可以通过刺激细胞分泌趋化性的细胞因子来增高细胞趋化性，而PD可以减低LPS的这种作用，从而使细胞的趋化性不

25、至于过高，这样即保持了对外界刺激的正常反应性，又可以使细胞不至于被过度激活而发生聚集，从而在炎症和感染性休克中起到保护组织细胞的作用。我们还利用转染了FPRL1受体基因的细胞株研究了PD影响细胞趋化性的可能途径。由于野生型的HEK-293细胞为人胚胎肾细胞，本身不具有趋化活性。而FPRL1/293细胞株中由于转染了FPRL1基因并稳定表达，因此可以对利用FPRL1受体的趋化因子表现出一定的趋化活性。在本次实验中，我们观察到，LPS可以明显增强FPRL1/293细胞株对fMLP的趋化活性。而PD则可以减低由LPS刺激引起的FPRL1/293细胞株的趋化活性增高。这就提示PD可能是通过影响FPRL

26、1的表达和/或功能来发挥其作用的。FPRL1是甲酰化肽受体FPR的异构体，是一些自然的N-甲酰肽趋化剂包括N-甲酰肽原型fMLP的膜受体。N-甲酰化肽是最先分离出来的和最重要的化学趋化剂。自从由细菌上清中提纯以后，证实了它们是PMN及巨噬细胞上甲酰化肽受体（formyl peptide receptor,FPR）的配基。FPRL1是由FPR变异的克隆发现的，它能与高纳摩尔至低微摩尔浓度的fMLP发生低亲和力的作用，通过FPRL1介导的信号传导通路还没有进行深入的研究。然而，与FPR 高度的同源性、对百日咳毒素敏感、介导有力的巨噬细胞泳动和可以使激动剂活化提示FPRL1和FPR可能在活化后有一些

27、相同的信号传导步骤。由于炎症过程中坏死组织释放的线粒体蛋白同样是N-甲酰化的，因此FPRL1的功能状态在炎症调控过程中起了重要的作用10。在本次实验中我们发现，PD可以明显降低由LPS引起的FPRL1/293细胞株的趋化活性的升高，因此我们认为，PD可以通过调节在炎症反应发生和调控过程中起重要作用的FPRL1的功能来调节细胞趋化性，从而避免过度炎症反应的发生。因此，PD可以通过调节LPS刺激后白细胞分泌趋化因子及趋化因子膜受体结合趋化因子的活性来调节白细胞趋化作用，避免过度炎症反应，在抗感染性休克中发挥了重要的作用。但PD具体可以调节哪些趋化因子的分泌及趋化因子膜受体结合趋化因子能力的改变是由

28、于受体数量的改变或结合能力的改变还有待于进一步的研究。参考文献1. Ulevitch RJ, Tobias PS.Receptor-dependent mechanisms of cell stimulation by bacterial endotoxin. Annu Rev Immunol. 1995;13:437-57. 2. 黄海潇,赵清,金春华.虎杖甙对LPS刺激下中性粒细胞趋化性的影响.第一军医大学学报, 2003;23(12):1253-56. 3. 金丽娟,王静珍. 青藤碱对补体激活的中性粒细胞形态学改变和脱颗粒的抑制作用. 中国药理学通报. 1992; (4), 288- 291.4. Su SB,Gao JL, Shen W, Murphy PM, Oppenhe